Detailansicht

Origin and function of RNA modifications in the Drosophila RNAi pathway
Raphael Manzenreither
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Stefan Ameres
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30107.93674.317863-4
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Das Stilllegen von Genen durch kleine RNA Moleküle kontrolliert die Entwicklung von Organismen, Physiologie und Krankheit in Pflanzen und Tieren und wird oft als Verteidigung gegen fremde genetische Elemente benutzt. In Drosophila melanogaster ist der small interfering RNA (siRNA) Weg essenziell für antivirale Abwehr durch RNA Interferenz (RNAi). In diesem Prozess generiert Dicer-2 ~21 nt lange small RNA Duplexe aus doppelsträngigen Virus Replikationsintermediaten, welche anschließend in Ago2 geladen werden. Diese werden dann in einzelsträngige Guides konvertiert welche sequenzspezifisch hoch komplementäre Virus Transkripte erkennen und endonukleolytisch spalten. Es ist viel über Komponenten und die Funktion von RNAi bekannt, aber die intrazelluläre Kinetik dieser Prozesse ist noch unbekannt. Dafür entwickelte ich einen experimentellen Rahmen für die quantitative, molekulare Charakterisierung von siRNAs und deren Modifikationen in RNAi in Drosophila S2 Zellen. Diese Analysen zeigten ein dynamisches Wechselspiel zwischen stabilisierender siRNA Methylierung, katalysiert durch Hen1, und destabilisierenden 3 ́ terminalen Uridylierungen katalysiert durch die terminale Uridyltransferase Tailor. Uridylierung durch Tailor ist wahrscheinlich eine indirekte Konsequenz eines Weges, der siRNA-directed mRNA Spaltprodukte markiert, da ich zeigen konnte, dass siRNA-directed mRNA Spaltprodukte auch durch Tailor uridyliert werden. Durch die Etablierung von CRISPR/Cas9-directed Genom Editierung konnte ich zeigen, dass der Verlust von Hen1 in S2 Zellen diese anfälliger für Virusinfektionen macht, was eine wichtige biologische Funktion von Hen1 offenbart. Insbesondere zeigte ich, dass der Verlust von Hen1 zu globaler, Ziel- RNA unabhängiger siRNA Destabilisierung durch Tailor-directed Uridylierung führt, was eine wichtige Funktion von Hen1-directed Methylierung in Ago2 Ladung bestätigt. Zusammengefasst enthüllt diese Arbeit den Ursprung und die Konsequenzen von RNA Modifikationen im RNAi Weg in Fliegen. Das vorgeschlagene Modell stellt einen Starpunkt für weitere Analyse der Funktion von RNA Uridylierung und ihren Einfluss auf antivirale Abwehr in Fliegen bereit.
Abstract
(Englisch)
Small RNA-mediated gene regulation controls organismal development, physiology and disease in plants and animals and is frequently employed for the defense against foreign genetic elements. In Drosophila melanogaster, the small interfering RNA (siRNA) pathway is essential for efficient antiviral defense by RNA interference (RNAi). In this process, Dicer-2 generates ~21nt small RNA duplexes from double-stranded virus replication intermediates that are subsequently loaded into Argonaute 2 (Ago2) and converted into single stranded guides, enabling the sequence-specific recognition and endonucleolytic cleavage of highly complementary virus transcripts. Much is known about the components and functions of RNAi, but the intracellular kinetics of these processes remain obscure. Here, I developed an experimental framework for the quantitative molecular characterization of siRNAs and their post-transcriptional modifications in the course of an effective RNAi response in Drosophila cells. These analyses revealed a dynamic interplay between stabilizing siRNA methylation, mediated by the methyltransferase Hen1, and destabilizing 3 ́ terminal uridylation, directed by the terminal uridylyl- transferase Tailor. Uridylation of siRNAs is likely a indirect consequence of a pathway that marks siRNA-directed mRNA cleavage products, because I could show that siRNA-directed cleavage of mRNAs results in CG1091/Tailor-directed uridylation of 5 ́ mRNA cleavage products. Finally, by establishing CRISPR/Cas9-directed genome editing in Drosophila S2 cells, I could show that S2 cells depleted of Hen1 exhibit an increased susceptibility to virus infection, revealing an important biological function of Hen1. Notably, Hen1-depletion caused the global, target RNA-independent destabilization of siRNAs by Tailor-directed uridylation, confirming an important function of Hen1-directed methylation in the loading of siRNAs into Ago2. In summary, this thesis uncovered the origin and consequences of RNA modifications in the RNAi pathway of flies. The proposed model provides a starting point for dissecting the function of destabilizing post-transcriptional RNA-uridylation and its impact on antiviral defense in flies.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
siRNA RNAi Hen1 Methylierung Tailing
Schlagwörter
(Deutsch)
siRNA RNAi Hen1 Methylierung Tailing
Autor*innen
Raphael Manzenreither
Haupttitel (Englisch)
Origin and function of RNA modifications in the Drosophila RNAi pathway
Paralleltitel (Deutsch)
Ursprung und Funktion von RNA Modifikationen im Drosophila RNAi Weg
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
89 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Stefan Ameres
Klassifikationen
42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Nummer
AC12403793
Utheses ID
33979
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1