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Synthesis of 2'-thioethyl modified adenosine and uridine and their use for generating peptide oligonucleotide conjugates

Felix Panis

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Johannes Winkler

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DOI

10.25365/thesis.38373

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30246.90775.301966-1

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Therapeutisch genutzte Oligonukleotide, z.B. ASONs oder siRNA, stellen eine vielversprechende Möglichkeit für die Therapie von Krankheiten dar. Im Zentrum der Forschung stehen dabei virale oder genetische Krankheiten, sowie Krebs oder Erkrankungen mit geringer Prävalenz. Obwohl das Konzept therapeutisch nutzbarer Oligonukleotide vor mittlerweile 30 Jahren vorgestellt wurde, sind bislang nur wenige Vertreter zugelassen wor-den. Bis heute gibt es einige Hürden, die es zu überwinden gilt, bevor therapeu-tisch genutzte Oligonukleotide breite Anwendung in der Medizin finden können. Dazu gehören vor allen pharmakokinetische und pharmakodynamische Hinder-nisse, wie beispielsweise kurze Halbwertszeiten, geringe Zellaufnahme und Zellspezifität sowie unerwünschte Nebenwirkungen. Deshalb wurden in den vergangenen Jahrzehnten zahlreiche chemische Modifi-kationen, Konjugationen und Transportsysteme für Oligonukleotide entwickelt. Diese Diplomarbeit beschäftigt sich mit der Konjugation von Oligonukleotiden mit Peptiden durch Einführung eines geeigneten Thiol-Linkers in die Nukleotide. In weiterer Folge wird dadurch eine Verbesserung der Zellaufnahme in Verbin-dung mit einer Wirkungssteigerung erwartet. Dabei wurden zuerst die Nukleotide, Uridin und Adenosin, chemisch so verän-dert, dass sie in der Lage sind, kovalent an Peptide zu binden. Im Anschluss daran wurden mittels RNA-Synthese Oligonukleotide, die diese chemisch ver-änderten Nukleotide enthalten, hergestellt. Es gelang ein geeignetes Syntheseschema für die Herstellung der modifizierten Nukleotide zu entwickeln. Dabei lag der Schwerpunkt auf der Verwendung ge-eigneter Schutzgruppen für den Thiol-Linker. Von mehreren getesteten Schutz-gruppen erwies sich dabei die S-trityl Gruppe als am besten geeignet. Zuerst wurde Anhydrouridin aus Uridin gewonnen, an das anschließend die Al-kylkette in 2‘-Position angehängt wurde. Nachdem die 5‘-OH Gruppe mittels DMTrCl geschützt worden war, wurde in 3‘-Position das Phosphoramidit ange-fügt, wodurch das angestrebte Endprodukt erhalten wurde. Für die Synthese des Adenosin Bausteins wurde 3’,5’-O-(tetraisopropyldi-siloxane-1,3-diyl)adenosine an der Aminofunktion des Adenins acetyliert und in 2‘-Position mit einer Methylthiomethyl Gruppe geschützt. Anschließend wurde die Silylspange mittels Fluorid entfernt und die 5‘-OH Gruppe mit DMTrCl ge-schützt. Im Anschluss daran wurden Phosphorothioate synthetisiert. Es konnte ein er-folgreiches Verfahren zur Kopplung dieser Oligonukleotide mit den Peptiden, sowie deren Aufreinigung, Entschützung und Regenration entwickelt werden, was durch die Ergebnisse der Gel-Elektrophorese bestätigt wurde.

Abstract

(Englisch)

Therapeutic oligonucleotides, such as ASONs or siRNA, are promising alterna-tives in treating illnesses and diseases. Most important in this context are genetic disorders, viral diseases, cancer and orphan diseases. Although the concept of using oligonucleotides therapeutically roots back almost three decades, just very few compounds have won approval so far. To date, there are still some major hurdles concerning pharmacokinetic and phar-macodynamic parameters, which slow down the success of oligonucleotide therapy. Hence, several chemical modifications, conjugations and specialized transport systems were developed over the last decades. During this diploma thesis, thiol-linker modified nucleotides were synthesized and incorporated into oligonucleotides for coupling with peptides in order to in-crease cellular uptake, which again would lead to improved efficacy. At first, the nucleotides, uridine and adenosine building blocks with protected thiol linkers for automated oligonucleotide synthesis were prepared, and their structure was verified by NMR and HRMS spectrometry. In line with this diploma thesis a synthesis route for the modified nucleotide was elaborated. Thereby, most effort was devoted to the selection of a suitable protection group for the thiol-linker, and the S-trityl function was identified to be most suitable out of several evaluated protection strategies. At first, uridine was transformed to anhydrouridine, followed by attachment of the alkyl chain to the 2’-hydroxy group. After protecting the 5’-hydroxyl group a phosphoramidite was attached at the 3’-OH, resulting in the final product. The synthesis of adenosine, starting from 3’,5’-O-(tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl)adenosine, involved the introduction of a methylthiomethyl chain at the 2’-hydroxyl group as well as an acetyl-protection group at the amino-group of ad-enine. Next, the silyl-bridge was removed using fluoride and the 5’-OH was pro-tected using DMTrCl. Next, phosphorothioates were synthesized and oligonucleotides containing these amended nucleotides, were prepared. Hereupon, a methodology for puri-fying the ONs, removing the trityl-protection group argentometrically and re-generating the sulphur of the uridine and thereby restoring an unprotected thiol function, was established. Subsequently, developing a suitable method for cou-pling them with lysine-rich peptides was achieved, as proven by the results of gel electrophoresis.

Autor*innen

Felix Panis

Haupttitel (Englisch)

Synthesis of 2'-thioethyl modified adenosine and uridine and their use for generating peptide oligonucleotide conjugates

Paralleltitel (Deutsch)

Synthese von 2'-thioethyl modifiziertem Adenosin und Uridin und deren Verwendung für die Herstellung von Peptid Oligonukleotid Konjugaten

Publikationsjahr

2015

Umfangsangabe

68 S. : Ill.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Johannes Winkler

Klassifikationen

35 Chemie > 35.62 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße ,

35 Chemie > 35.75 Nukleinsäuren

AC Nummer

AC12631255

Utheses ID

33995

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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Schlagwörter