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Photolithographic synthesis of microarrays

Nicole Kretschy

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (Dissertationsgebiet: Chemie)

Betreuer*in

Mark Manuel Somoza

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DOI

10.25365/thesis.38376

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29634.30839.588060-8

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die lichtinduzierte in situ MAS (Maskless Array Synthesis) ist eine leistungsstarke Methode um Mikroarrays zu produzieren, mit deren Hilfe eine Analyse von hunderttausend Sequenzen simultan möglich ist. Chemische und optische Komponenten werden durch die MAS kombiniert. Die optischen Komponenten ermöglichen die räumliche zielgerichtete Illumination durch Licht welche durch einen Mikrospiegelaktor kontrolliert wird. Das chemische System hingegen liefert Reagenzien und Lösungsmittel an die funktionalisierte Glasoberfläche wo die Synthese des Mikroarrays stattfindet. Die Synthese von Microarrays erlaubt durch ein hoch flexibles aber auch komplexes Design eine Anpassung an die Anforderungen der verschiedensten Anwendungen. Ein Bedarf für die weiterere Erforschung und Optimierung der Synthese und der darauffolgenden Prozesse wie die Entfernung der Schutzgruppen und die Hybridisierung ist aber dennoch gegeben. In dieser Doktorarbeit ist der Hauptfokus auf die Optimierung der Herstellung und auf alle Prozesse die eine Herstellung eines hoch verdichteten „light directed“ Mikroarrays beinhalten gerichtet. Durch unsere Forschung konnte die Effizienz der Synthese mittels Benutzung einer modifizierten photochemischen Zelle verdoppelt werden. Zusätzlich wurde eine neue Methode entwickelt die die Spaltung und das Sammeln der produzierten Oligonukleotiden beinhaltet. Diese kann genutzt werden um die Effizienz der Entschützung und die Genauigkeit mit der die Oligonucleotide synthetiesiert wurden zu bestimmen. Die Bestimmung gelingt durch HPLC und Massenspektrometrie. Durch Nutzung einer anderen photolabilen Entschützungsgruppe wurde die Effizienz der Photoentschützung um das Zwei- bis Zwölffache erhöht. Die Ermittlung des sequenzabhängigen Musters von DY547 und DY647 das mit den etablierten Cyaninfarbstoffe Cy3 und Cy5 verglichen wurde, ermöglicht es zu bestimmen wie die Interaktion des Farbstoffes das Fluoreszenzsignal in Mikorarray-, PCR-, FRET- und Sequenzierungsexperimenten beeinflusst. Weiteres wurde die Identifizierung der optimalen Bedingungen für die Herstellung eines Aptamer Mikroarrays erreicht und eine Bestätigung, dass miRNA Regulation Einfluss auf Fettgewebe hat erziehlt. Die Erforschung der Optimierung der Produktion von DNA-Mikroarrays kreiert einen Ansporn für neue Erfindungen auf diesem Gebiet. Eine der möglichen weiteren Erfindungen könnte die Produktion von hochverdichteten RNA Microarrays beinhalten. Die hohe Komplexität der Aptamere könnte zu weiteren Analysen mit einer Vielzahl von Aptameren führen, um das volle Ausmaß an Variabilität zu verstehen.

Abstract

(Englisch)

Light-directed in situ microarray synthesis is a powerful tool to detect over a hundred thousand of sequences simultaneously. The microarrays are produced by using MAS (maskless array synthesizer). The MAS combines the optical and chemical synthesis. The optical synthesis provides a spatially addressable illumination of light performed by using a digital micromirror device, while the chemical system delivers solvents and reagents to the functionalized glass surface where the microarray synthesis takes place. The synthesis offers high spectra of designs and modifications to adapt to the requirements of the applications. Therefore there is a need to investigate the optimization of the synthesis and the ensuing processes which involves deprotection and hybridization to assure the consistent quality of the microarray. In this thesis the main focus was to achieve optimization in every field which is needed to create a light directed in situ microarray. Due our research the efficiency of the synthesis was doubled by using a modified photochemical cell where the synthesis takes place. Additional the development of a new cleavage method which is also suitable for in situ microarrays enables analysis of the deprotection status by MS or HPLC. Through usage of different photolabile deprotection groups, the photodeprotection was increased by two to twelve folds. The determination of the sequence dependence pattern of DY547 and DY647 in comparison with the well-established cyanine dyes Cy3 and Cy5 extended the spectra of the possible influence which can affect the hybridization signal and helped to understand them better. Further the identification of the optimized conditions for the fabrication of an aptamer microarray and also the confirmation that miRNA regulation has an influence of on adipose was achieved. The exploration of the optimization of the fabrication of DNA Microarrays creates also an incentive to further develop inventions towards this field. One of the possibly further inventions could be the fabrication of high density RNA microarrays. Additionally, the high complexity of aptamers could lead to further analysis with a variety of aptamers to understand the full extent of variability.

Autor*innen

Nicole Kretschy

Haupttitel (Englisch)

Photolithographic synthesis of microarrays

Paralleltitel (Deutsch)

Photolithographische Synthese von Mikroarrays

Publikationsjahr

2015

Umfangsangabe

81 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Christopher Gerner ,

Martin Bilban

Klassifikation

35 Chemie > 35.75 Nukleinsäuren

AC Nummer

AC12698288

Utheses ID

33996

Studienkennzahl

UA | 796 | 605 | 419 |

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