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Role of N-linked glycosylation sites of ENaC alpha subunit in TNF-alpha induced activation
Dina El-Malazi
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Rosa Lemmens-Gruber
DOI
10.25365/thesis.38445
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29296.05543.416954-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das nicht–kardiale Lungenödem beruht auf einer Dysbalance der alveolären Flüssigkeitsclearance in der Lunge und kann eine lebensbedrohliche Erkrankung darstellen.
Der epitheliale Natriumkanal auf der apikalen Seite der alveolären Epithelzellen spielt in Zusammenarbeit mit der basolateralen Na+/K+-ATPase eine entscheidende Rolle in der Aufrechterhaltung und Regulation des Flüssigkeitshaushaltes und ist verantwortlich für den vektoriellen Salz- und Wassertransport durch das alveoläre Epithel. Eine Dysfunktion dieses Natriumkanals äußert sich in Komplikationen, wie akute Lungenschädigung und Atemnotsyndrom.
Abgesehen von künstlicher Beatmung gibt es zur Zeit keine wirkungsvolle Therapie. Eine vielversprechende Lösung stellt die Wiederherstellung der alveolären Flüssigkeitsclearance durch Erhöhung der Aktivität des Natrium-Kanals dar. Es konnte gezeigt werden, dass das Zytokin, der Tumor-Nekrose-Faktor alpha mit Hilfe seiner lektin-ähnlichen Domäne die Natrium- Aufnahme über den amilorid-sensitiven Kanal in alveolären Typ II Zellen stimulieren kann und somit die alveoläre Flüssigkeitsclearance erhöhen kann.
Jedoch ist der Wirkmechanismus noch nicht vollständig aufgeklärt. Es gibt dennoch Hinweise, dass TNF-α mit seiner lektin-ähnlichen Domäne an Zuckerketten in der Extrazellulären Schleife der α-ENaC Untereinheit bindet. Daher wurden zahlreiche zyklische Peptide synthetisiert, die sich von der lektin-ähnlichen Domäne von TNF-α ableiten. Eines davon ist das Peptid AP301, welches inzwischen in der klinischen Prüfung die Phase II bereits erfolgreich durchlaufen hat.
Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde daher der Effekt von TNF-α in transient transfektierten HEK293 Zellen mittels whole cell Patch Clamp Technik untersucht und die EC50 ermittelt. Die Rolle der Zuckerketten bei der Aktivierung von ENaC durch TNF-α wurde mit Hilfe von Punktmutationen ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die EC50 der mutierten α Untereinheit (N511Q) im Vergleich zum Wildtyp (WT) leicht erhöht ist.
Zusammenfassend lässt sich daher sagen, dass ein Zusammenhang zwischen dem TNF-α induzierten Effekt in ENaC und den Zuckerketten besteht. Für eine definitive Aussage wären jedoch weitere Versuche mit einer kompletten Deglykosylierung notwendig.
Abstract
(Englisch)
Non-cardiogenic pulmonary edema is a complication within the lung due to a dysbalance of alveolar lung liquid clearance (ALC) and can be a life-threatening disease. The epithelial sodium channel (ENaC) at the apical surface of the alveolar epithelial cells plays a crucial role in maintaining ALC by working in conjunction with the basolateral located Na+/K+-ATPase. A dysfunction of its activity reveals in impaired ALC and further leads to acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS).
To date, besides mechanical ventilation strategies no standard treatment exists. A promising strategy for therapy might be enhancement of ENaC activity and in this way increase ALC. It has been demonstrated that the lectin-like domain of the cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) is able to activate the sodium uptake by amiloride-sensitive sodium channel in alveolar type II cells and thereby increases ALC.
However, the cellular mechanism of interaction is not cleared up. Studies have shown that the effect of TNF-α requires its lectin-like domain binding to the sugar moieties within the extracellular loop of α ENaC subunit. Hence, several cyclic peptides mimicking the lectin-like domain of TNF-α (TIP) were synthetisized such as AP301, a TIP-peptide which has already passed clinical research phase II.
Therefore, the effect of TNF-α was studied in transiently transfected HEK293 cells by conducting whole cell patch clamp technique. And the role of the N-linked glycosylation sites was studied by site-directed mutagenesis. Moreover, the EC50 was examined.
The study indicates that the EC50 of TNF-α is slightly shifted to a higher concentration in α human ENaC mutants lacking one certain glycosylation site (N511Q) in comparison to human ENaC WT.
In conclusion, this research demonstrates a relation between TNF-α induced activation of ENaC and the N-linked glycosylation sites, but there is need for further testings after full deglycosylation.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
non-cardiogenic pulmonary edema epithelial sodium channel (ENaC) TNF-alpha lectin-like domain glycosylation sites
Schlagwörter
(Deutsch)
nicht-kardiale Lungenödem epithelialer Natriumkanal (ENaC) TNF-alpha lektin-ähnliche Domäne Glykosylierungsstellen
Autor*innen
Dina El-Malazi
Haupttitel (Englisch)
Role of N-linked glycosylation sites of ENaC alpha subunit in TNF-alpha induced activation
Paralleltitel (Deutsch)
Bedeutung der Glykosylierungsstellen der ENaC alpha Untereinheit bei einer TNF-alpha induzierten Aktivierung
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
IV, 49 Bl. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Rosa Lemmens-Gruber
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.99 Naturwissenschaften allgemein: Sonstiges
AC Nummer
AC12631358
Utheses ID
34059
Studienkennzahl
UA | 449 | | |