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Trans-ganglionic neurotransmission in the autonomic nervous system
lessons from knock-out mice
Xenia Simeone
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Dr.-Studium der Naturwissenschaften Biologie
Betreuer*in
Rosa Lemmens-Gruber
DOI
10.25365/thesis.38449
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30067.98047.768062-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In meiner Dissertationsarbeit habe ich die synaptische Transmission im oberen Halsganglion (superior cervical ganglion, SCG) in Mäusen untersucht. Das SCG innerviert diverse Bereiche in Kopf und Hals und dient als Schaltstelle des sympathischen Nervensystems, wo nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) für eine rasche exzitatorische Neurotransmission verantwortlich sind. Untersucht wurden Wildtyp- (WT) Mäuse und Knockout- (KO) Mäuse, bei denen gezielt die Gene ausgeschaltet wurden, welche für die Untereinheiten α5, α7, β2 und β4 des nAChR kodieren. Konkret handelt es sich hier um α5KO, α5β2KO, α5β4KO, α5α7β2KO und α5α7β4KO Tiere. Heteromere nAChRs im SCG von WT Mäusen bestehen aus den Untereinheiten α3β4 (55%), α3β4α5 (24%) und α3β4β2 (21%).
α5β4KO Mäuse wuchsen langsamer heran, und ihre SCGs weisen morphologische Unterschiede auf, die auf eine verzögerte Reifung deuten. Wie durch Immunpräzipitation (IP) bestimmt, findet man in diesem Genotyp nur 15% nAChRs, verglichen mit WT und α5β2KO Mäusen. α5β4KO Mäuse exprimieren außerdem nur α3β2 heteromere Rezeptoren, die sich hinsichtlich ihrer biophysikalischen Eigenschaften deutlich von den Rezeptoren in WT und α5β2KO (die lediglich α3β4 heteromere Rezeptoren enthalten) unterscheiden, wie frühere Zellkulturexperimente belegen. Dementsprechend sind die durch Acetylcholin (ACh) ausgelösten Ströme in α5β4KO Mäusen fünfmal kleiner, sie fallen während der Aktivierung durch ACh schneller ab, und sie desensitivieren bei chronischer Applikation von Nikotin bereits bei Konzentrationen, die zehnmal geringer als in WT oder α5β2KO Tieren sind.
Ziel meiner Arbeit war, mittels extrazellulärer Ableitungen vom efferenten Nerven (als compound action potential, CAP) sowie intrazellulärer EPSP Aufzeichnungen, die transganglionäre Neurotransmission im intakten SCG der erwähnten Genotypen, insbesondere aber in α5β4KO Mäusen zu untersuchen. Aufgrund der sehr unterschiedlichen biochemischen und elektrophysiologischen Eigenschaften der nAChR in diesen Mäusen hatten wir erwartet, dass sich auch Unterschiede in der synaptischen Transmission zeigen würden. Die Versuche haben allerdings gezeigt, dass die Unterschiede vergleichsweise gering sind: supramaximale Reizungen erzeugten auch in α5β4KO Mäusen CAPs mit vergleichbarer Amplitude, auch wenn fast doppelt so hohe Reizstärken zur Auslösung von Schwellenwert-CAPs im Vergleich zu WT oder α5β2KO notwendig waren.
Durch den Vergleich von α5β2 Doppel KO mit α5 Einzel KO Tieren konnte ich die Auswirkung der α5 Untereinheit auf die Funktion von α3β4 Rezeptoren abschätzen. So war der Ganglienblocker Hexamethonium in Rezeptoren von Genotypen ohne α5 signifikant potenter als in α5 hältigen Rezeptoren. Modellrechnungen auf Basis dieser Beobachtungen zeigten, dass α5 hältige Rezeptoren sowohl in der Synapse des SCG als auch auf der Zelloberfläche weit mehr verbreitet zu sein scheinen als unsere IP Experimente vermuten ließen. Demzufolge könnten α3β4α5 Rezeptoren der Zelloberfläche 2 4 mal häufiger vorkommen als α3β4 Rezeptoren, während unsere IPs auf ein umgekehrtes Verhältnis deuteten, bei dem die α3β4 Rezeptoren die α3β4α5 Rezeptoren im Verhältnis 3:1 übertrafen.
Im Gegensatz zu früheren Beobachtungen im SCG von Ratten und Meerschweinchen konnte ich in keinem der getesteten Genotypen eine Langzeitpotenzierung nachweisen. Interessanterweise trat im WT eine paired pulse facilitation auf (verstärkte postsynaptische Antwort nach zweimaliger Reizung des präsynaptischen Eingangs), welche bei Fehlen der Untereinheiten α5 oder β4 nicht erfolgte.
Intrazelluläre EPSP Ableitungen lassen vermuten, dass das SCG in der Maus keine „strong inputs“ enthält: Die synaptische Antwort war bei Neuronen, deren Membranpotential nicht durch Strominjektion manipuliert wurde, stets mit einem Aktionspotential kombiniert. Um somit EPSPs zu messen musste das Membranpotential durch Strominjektion auf -100 mV verringert werden. Diese Versuche zeigten keine signifikanten Unterschiede in den EPSP Amplituden der verschiedenen Genotypen. Allerdings fielen die EPSPs in WT oder α5β2KO Mäusen im Vergleich zu α5β4KO Mäusen mehr als doppelt so schnell ab.
Zusammengefasst weisen meine Daten darauf hin, dass die synaptische Transmission im SCG mit einer großen Zuverlässigkeit (high safety factor) arbeitet, und dass β2 (die klassische β Untereinheit des zentralen Nervensystems) β4 (die klassische β Untereinheit des autonomen Nervensystems) effizient ersetzen kann. Außerdem sprechen wir der akzessorischen Untereinheit α5 größere modulatorische Fähigkeiten zu als bisher beschrieben, da sie nicht nur die Pharmakologie und Affinität des nikotinischen Acetylcholinrezeptors beeinflusst, sondern auch für die Kurzzeitplastizität des SCG eine Rolle zu spielen scheint.
Abstract
(Englisch)
I studied transganglionic neurotransmission in the superior cervical ganglion (SCG) of wild type (WT) mice and of mice with targeted deletions of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) subunit genes α5, α7, β2 and β4. Nicotinic AChRs mediate fast excitatory transmission in the SCG, which serves as a relay station of the sympathetic nervous system and innervates parts of the head and neck. Heteromeric receptors that occur in the wild type mouse SCG consist of α3β4 (55%), α3β4α5 (24%), and α3β4β2 (21%), as previously resolved by our lab. The knockout (KO) mice I used were α5KO, α5β2KO, α5β4KO, α5α7β2KO and α5α7β4KO.
α5β4KO mice showed a reduced body growth and a different SCG morphology, possibly indicating a slower maturation. The overall number of nAChRs in the SCG is dramatically reduced (to 15% of nAChRs found in WT mice) in these mice. α5β4KO mice furthermore express just α3β2 nAChRs, which greatly differ in their biophysical properties from receptors found in WT and α5β2KO animals. Previous cell culture experiments have shown that in α5β4KO mice, peak currents in response to ACh were five times smaller and declined much more rapidly than in WT or α5β2KO mice. Additionally, α3β2 receptors were about ten times more sensitive to desensitisation by chronically applied nicotine. Having assessed the biochemical and electrophysiological properties of these receptors we now wanted to learn whether transganglionic transmission - measured with extracellular CAP as well as with intracellular EPSP recordings - in the α5β4KO might also be impaired.
Despite all the alterations mentioned above, neurotransmission in α5β4KO mice was nearly normal: upon supramaximal stimulation, the amplitude of CAPs was not reduced in α5β4KO mice, although threshold CAPs required nearly two times the stimulation strength compared to WT or α5β2KO mice.
By comparing α5β2 double-KO with α5 single-KO, I was able to assess the impact of the α5 subunit on the function of α3β4 receptors. I thus found that the potency of the ganglionic blocker hexamethonium was significantly increased in mice lacking the α5 subunit. Additionally, the modelling of my data suggests that α5-containing receptors are present on the cell surface and in synapses of the SCG to a greater extent than predicted from our previous immunoprecipitation (IP) experiments. Hence, when looking at cell surface receptors with electrophysiological and pharmacological tools, α3β4α5 appeared to exceed α3β4 receptors about 2 4 times, while previous IP experiments had shown that α3β4 outnumber α3β4α5 receptors with a 3:1 ratio.
Contrary to previous observations in the SCG of rats and guinea pigs, I was unable to induce long term potentiation in any of the mouse genotypes. Still, paired pulse facilitation occurred in WT mice but not in mice lacking the α5 or the β4 subunit.
Intracellular EPSP recordings implied that mouse SCGs only contain strong inputs, since all neurons produced an action potential as the first response when tested at resting membrane potential. The underlying EPSPs measured at -100mV showed similar amplitudes between all genotypes, but the EPSP decay in α5β4KO mice was more than two times less than in WT or α5β2KO mice.
Taken together, my data suggest that synaptic transmission in the SCG functions with a high safety factor, and that β2 can efficiently replace β4 as the classical β-subunit in the autonomic nervous system. Major modulatory effects than expected are assigned to the accessory subunit α5, which not only alters receptor pharmacology and antagonist affinity, but also plays a role in short time plasticity of the SCG.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Sympathetic nervous system transganglionic neurotransmission nicotinic acetylcholine receptors SCG knock-out mice
Schlagwörter
(Deutsch)
Sympathisches Nervensystem transganglionäre Neurotransmission Nikotinischer Acetylcholinrezeptor SCG Knockout-Mäuse
Autor*innen
Xenia Simeone
Haupttitel (Englisch)
Trans-ganglionic neurotransmission in the autonomic nervous system
Hauptuntertitel (Englisch)
lessons from knock-out mice
Paralleltitel (Deutsch)
Trans-ganglionäre Neurotransmission im autonomen Nervensystem ; was wir von Knockout-Mäusen lernen
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
147 S. : Ill, graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Elspeth McLachlan ,
Lars Peter Klimaschewski
AC Nummer
AC12631407
Utheses ID
34061
Studienkennzahl
UA | 091 | 437 | |