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DEAD-box protein facilitated folding of the group II intron ai5gamma in vivo
Andreas Liebeg
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Christina Waldsich
DOI
10.25365/thesis.38548
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29406.88453.805661-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das DEAD-box protein Mss116p ist unabdingbar für das aerobe Wachstum von Hefe, indem es alle Gruppe I und II Introns im mitochondriellen Genom beim Splicen unterstützt. Das Gruppe II intron ai5g verbleibt ungefaltet, falls Mss116p in vivo nicht präsent ist. Es ist jedoch rätselhaft wie Mss116 ai5g dabei hilft, seine aktive Struktur zu erlangen. Eine Möglichkeit besteht darin, dass das DEAD-box Protein seine Helikaseaktivität dazu nutzt, falsch gefaltete Regionen wieder aufzulösen, um eine korrekte Faltung zu erlauben. Im Gegensatz dazu wurde vorgeschlagen, dass Mss116p eine Intermediärstruktur stabilisiert, die essenziell für die weitere Faltung ist. Mit einer PCR-basierte Methode führten wir unterschiedliche Mutationen in das Genom von Hefeein, welche wichtige Aktivitäten von Mss116p ausschalten. Diese Aktivitäten bestanden in der spezifischen Bindung des RNA-Substrats, in der Bindung und Hydrolyse von ATP sowie im Aufwinden von doppelsträngiger RNA. Anschließend kartierten wir die Struktur von ai5g in den unterschiedlichen Hefestämmen mit chemischer Modifizierung in vivo. Die Struktur von ai5g ohne ATP-Bindung und –Hydrolyse, wo ein wiederholtes Binden von Mss116p nicht mehr möglich ist, ähnelt stark der Situation ohne Kofaktor. Bei Entfernen des C-terminalen Schwanzes ist das Gruppe II Intron ebenso stark entfaltet. Bei Inaktivierung der Helikaseaktivität waren die geringsten Effekte beobachtbar, wobei diese sich hauptsächlich auf Konstituenten des aktiven Zentrums beschränkten. Mss116p scheint ein multifunktionelles Enzym zu sein, welches seinen C-terminalen Schwanz zur spezifischen Bindung des RNA-Substrats nutzt und mittels mehreren Runden von Protein-RNA-Bindungsvorgängen eine intermediäre Struktur stabilisiert. Außerdem stellt es mittels seiner Helikaseaktivität sicher, dass sich native Strukturelemente nicht vorzeitig bilden.
Abstract
(Englisch)
The DEAD-box protein Mss116p is essential for aerobic growth of yeast assisting in splicing of all group I and II introns found in the mitochondrial genome. The group II intron ai5g remains largely unfolded if Mss116p is not present in vivo, but it is enigmatic how Mss116p helps ai5g adopting its native structure. It was proposed that the DEAD box protein uses its helicase activity to unwind misfolded species thus allowing native folding. In contrast, a smooth folding landscape was postulated where Mss116p does not act as a chaperone but by stabilizing an on-pathway intermediate at the core of the ribozyme. By applying a PCR based method we generated yeast strains harboring different chromosomal mutations which disrupt specific activities of Mss116p, namely ATP binding and hydrolysis, RNA binding and RNA unwinding. We then mapped the structure of ai5g in these different genetic backgrounds using an in vivo chemical probing technique. The structure of ai5g with disrupted ATP binding and hydrolysis activity, where protein turnover is abolished, highly resembles the state in a Dmss116 strain. Deleting the C-terminal tail, which is important for specific RNA binding, also results in a largely unfolded group II intron. Disrupting the helicase activity of Mss116p showed the least impact on ai5g’s structure, being mostly clustered around active site constituents. Thus Mss116p appears to be a multifunctional enzyme using specific binding by its C-terminal tail as well as protein turnover exerted by ATP binding and hydrolysis to stabilize an on-pathway intermediate while ensuring correct active site assembly by unwinding prematurely formed native structure elements.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
RNA helicase group II intron folding DEAD-box ATPase ai5g Mss116
Schlagwörter
(Deutsch)
RNA Helikase Gruppe II Intron Faltung DEAD-box ATPase ai5g Mss116
Autor*innen
Andreas Liebeg
Haupttitel (Englisch)
DEAD-box protein facilitated folding of the group II intron ai5gamma in vivo
Paralleltitel (Deutsch)
DEAD-box Protein unterstützte Faltung des Gruppe II Introns ai5gamma in vivo
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
149 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Tobias Madl ,
Christoph Flamm
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12637032
Utheses ID
34152
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |