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Studying Potential Interactions of LAP2alpha with Chromatin Modifiers
Michael Peter Skoruppa
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Roland Foisner
DOI
10.25365/thesis.38895
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29586.84261.245664-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Lamina-assoziiertes Polypeptid 2alpha (LAP2alpha) repräsentiert eine von insgesamt sechs, in Säugetieren vom LAP2 Gen kodierten Isoformen. Im Gegensatz zu den anderen LAP2 Isoformen, welche integrale Proteine der inneren Kernmembran sind, ist LAP2alpha ein lösliches Protein und einheitlich im Nukleoplasma verteilt. Wie alle LAP2 Proteine, besitzt LAP2alpha unterschiedliche Domänen, welche mit DNA direkt, oder indirekt über ein DNA-quervernetzendes Protein namens Barrier-to-Autointegration Factor (BAF) interagieren können. LAP2alpha interagiert auch mit einem spezifischen Lamin-Pool im Inneren des Zellkerns, der an der Kontrolle der Zellproliferation und der Regulation und Organisation von Chromatin beteiligt ist. Um einen detaillierteren Einblick in LAP2alpha‘s potentielle molekulare Mechanismen zu erhalten, wurde im Vorfeld das LAP2alpha-Interaktom mit Hilfe einer Proximitäts-basierenden Methode, der sogenannten BioID, ermittelt. Dazu wurde ein Fusionsprotein, bestehend aus LAP2alpha und einer universellen Biotin Ligase (BirA*), generiert und in Zellen exprimiert und die daraufhin biotinilierten Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert. Für meine Masterarbeit wurden aus diesen zahlreichen potentiellen LAP2alpha Interaktionspartnern Kandidaten ausgewählt, die eine Rolle in der Zellzykluskontrolle und Chromatinregulation spielen, um deren Interaktion mit LAP2alpha in Hela Zellen und LAP2alpha Wildtyp und Knockout Mausfibroblasten näher zu verifizieren. Dafür wurden mikroskopische (Co-Lokalisation in Immunfluoreszens-Mikroskopie und Proximitäts-basierende Ligation (PLA)) und biochemische (Co-Immunoprezipitation) Methoden angewandt. Innerhalb der sechs getesteten Kandidaten konnten wir die Chromatin modifizierenden Proteine SMARCA4 und CHD4 als potentielle Interaktionspartner von LAP2alpha identifizieren. Beide Proteine co-lokalisierten mit LAP2alpha in beiden Zelltypen innerhalb spezifischer Bereiche im Inneren des Zellkern, konnten mit LAP2alphaco-präzipitiert werden und ergaben in den PLA Experimente, in Kombination mit LAP2alpha, positive Ergebnisse. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass SMARCA4 und CHD4 als potentielle Interaktionspartner von LAP2alpha verifiziert wurden und man kann daraus schließen, dass LAP2alpha zumindest teilweise über eine Interaktion mit diesen Proteinen in der Organisation von Chromatin eine Rolle spielt.
Abstract
(Englisch)
The Lamina-associated polypeptide 2 alpha (LAP2alpha) represents one of six isoforms encoded by the mammalian LAP2 gene. Unlike the other LAP2 isoforms, which are integral membrane proteins of the inner nuclear membrane, LAP2alpha is a soluble protein localizing throughout the nucleoplasm. LAP2alpha, like all LAP2 proteins, contains several domains known to interact with DNA directly or the DNA-cross linking protein Barrier-to-Autointegration Factor (BAF). LAP2alpha also interacts with a specific pool of lamins in the nuclear interior and this complex has been implicated in cell proliferation control and chromatin regulation. To get more insight into the potential molecular mechanisms how LAP2alpha functions in these processes, a previous study identified the LAP2alpha interactome using the proximity based BioID assay. In this study, a fusion protein of LAP2alpha and a promiscuous biotin ligase (BirA*) was expressed in cells and biotinylated proteins were identified as potential LAP2alpha interaction partners. In this thesis we selected several candidate proteins from this screen, known to be involved in cell cycle control and chromatin organization and aimed at confirming their interaction with LAP2alpha by other means, including co-localization immunofluorescence microscopy, co-immunoprecipitation and proximity ligation (PLA) assays, using HeLa cells and wild-type LAP2alpha and, as a control, LAP2alpha-deficient murine fibroblasts. Among the six candidates tested, we identified chromatin modifiers SMARCA4 (a component of SWI/SNF) and CHD4 (a component of the NuRD complex) as potential LAP2alpha interaction partners. Both proteins co-localized with LAP2alpha in specific loci throughout the nuclear interior in both cell types and co-precipitated together from cell lysates, using either LAP2alpha or SMARCA4 or CHD4 antibodies. Furthermore, PLA assays revealed positive signals upon targeting LAP2alpha and SMARCA4 or LAP2alpha and CHD4. Overall, our studies confirmed SMARCA4 and CHD4 as potential interaction partners of LAP2alpha, and suggest that LAP2alpha may affect chromatin organization at least in part through interaction with these proteins.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
LAP2alpha Chromatin Modifiers SMARCA4 CHD4 Lamins Interaction
Schlagwörter
(Deutsch)
LAP2alpha Chromatin-modifizierende Proteine SMARCA4 CHD4 Lamine Interaktion
Autor*innen
Michael Peter Skoruppa
Haupttitel (Englisch)
Studying Potential Interactions of LAP2alpha with Chromatin Modifiers
Paralleltitel (Deutsch)
Erforschung potentieller Interaktionen von LAP2alpha mit Chromatin-modifizierenden Proteinen
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
89 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Roland Foisner
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.17 Allgemeine Physiologie
AC Nummer
AC12707814
Utheses ID
34455
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |