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Insights into the modulation of the interaction between the Unique and SH3 domains in Src Family kinases
Simone Höfler
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Biologische Chemie
Betreuer*in
Robert Konrat
DOI
10.25365/thesis.38955
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29952.72074.508565-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Fyn-related Kinase (FRK) oder Rak ist eines der besser erforschten Mitglieder einer Familie von Nicht-Rezeptor Tyrosinkinasen, die sich aus FRK, PTK6/Brk (Breast Tumor Kinase) und SRMS (Src-related tyrosine kinase lacking C-terminal regulatory and N-terminal myristoylation sites) zusammensetzen. Im Gegensatz zu den strukturell nahe verwandten Src Family Kinasen (SFKs) haben die Mitglieder der FRK/PTK6 Familie keine N-terminale Lipidierung (Myristoylierung und/oder Palmitoylierung) und ebenso fehlt ihnen die Src-homolgy 4 (SH4) Domäne. Beiden Kinasefamilien sind die intrinsically disordered Unique Domäne, die Src-homolgy 3 und 2 (SH3 and SH2) Domänen sowie die C-terminale Kinasedomäne gemein.
Vorangegangene Untersuchungen der intrinsically disordered Unique Domäne von c-Src zeigten, dass diese Domäne mit der anschlie\textbeta enden SH3 Domäne und der cytoplasmatischen Seite der Zellmembran unter der Formation einer Peptidschlaufe innerhalb der Domäne interagiert. Diese Schlaufenbildung wurde u.a. auch in Fyn, einer weitern Src Family Kinase, beobachtet.
FRK besitzt zwei Cysteine in der Primärstruktur seiner Unique Domäne die in Regionen sind in denen sich konservierte aromatische Aminosäuren in den SFKs befinden, welche in die Formation der Peptidschlaufe involviert sind. Daher liegt die Hypothese nahe, dass diese beiden Cysteine an einer ähnlichen Schlaufenformation in FRK beteiligt sind, die zum Beispiel durch die Chelatierung von Metalionen zwischen den beiden Cysteinen bewirkt werden könnte.
Im Rahmen dieser Arbeit werden die erste Expression sowie Aufreinigung des N-terminalen Teils des humanen FRK Proteins, bestehend aus Unique und SH3 Domäne, beschrieben. Dieses Konstrukt wird in dieser Arbeit als FRK(USH3) bezeichnet.Ein vollständiges Protokoll, bestehend aus der Expression in E.coli, erfolgreichem Falten eines unlöslich-exprimierten Proteinkonstrukts und der Aufreinigung eines zur Aggregation neigendem Proteins für die Analyse über NMR Spektroskopie,wurde entwickelt. Des Weiteren wird das erste 1H-15N zwei-dimensionale NMR Spektrum von FRK(USH3) präsentiert.
Es konnte gezeigt werden, dass der N-terminal Teil von FRK bei Proteinkonzentrationen höher als 100M eine starke Tendenz zur Aggregation zeigt und daher nur in einem sehr niedrigen Konzentrationsbereich für die Analyse mittels NMR Spektroskopie verwendet werden kann. Derivatisierungsversuche, die in einer Maskierung der Thiolgruppen in den Cysteinseitenketten und der Erhöhung der Nettoladung des Konstrukts resultierten, konnten die Löslichkeit geringfügig erhöhen und die Aggregationstendenz senken. Dadurch konnte die Qualität der aufgenommenen NMR Spektren verbessert werden. Dynamic Light Scattering (DLS) und Native Polyacrylamidgelelektrophorese wurden verwendet um Unterschiede zwischen dem derivatisierten und nicht-derivatisierten Konstrukt zu analysieren.
Abstract
(Englisch)
The Fyn-related Kinase (FRK) or Rak is one of the leading members of a distinct family of non-receptor tyrosine kinases consisting of FRK, PTK6 or Brk (Breast Tumer Kinase) and SRMS (Src-related tyrosine kinase lacking C-terminal regulatory tyrosine and N-terminal myristoylation sites). In contrast to the structurally closely related Src Family Kinases (SFKs), members of the FRK/PTK6 family lack the N-terminal lipidation (myristoylation and/or palmitoylation) and also the Src-homology 4 (SH4) domain. Both families share the intrinsically disordered Unique domain, the Src-homology 3 and 2 (SH3 and SH2) domains and the C-terminal kinase domain.
Previous research on the intrinsically disordered Unique domain of c-Src revealed that the Unique domain interacts with the SH3 domain and the cytoplasmatic lipid layer of the cellular membrane under the formation of a peptide loop within the Unique domain. This loop formation has also been observed in Fyn, another SFK. FRK naturally provides two cysteine residues in regions of the Unique domain that are involved in the loop formation in c-Src and which could therefere be involved in a loop formation by metal ion chelation or other mechanisms.
In this work the first expression and purification of the N-terminal part of human FRK, containing Unique and SH3 domain, referred to as FRK(USH3), is described. A complete protocol involving expression in E. coli, successful refolding of an insoluble expressed construct and the purification of an aggregation prone protein for analysis by NMR spectroscopy was developed. Furthermore the first 1H-15N two-dimensional NMR spectrum of FRK(USH3) is reported.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
NMR spectroscopy intrinsically disordered proteins Src Family Kinases dynamic light scattering native polyacrylamide gelelectrophoresis protein refolding
Schlagwörter
(Deutsch)
NMR Spektroskopie intrinsically disordered proteins Src Family Kinasen dynamische Lichtstreuung native Polyacrylamidgelelektrophorese Proteinfaltung
Autor*innen
Simone Höfler
Haupttitel (Englisch)
Insights into the modulation of the interaction between the Unique and SH3 domains in Src Family kinases
Paralleltitel (Deutsch)
Einblicke in die Modulation der Interaktion zwischen der Unique und SH3 Domäne in den Src Family Kinasen
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
60 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Robert Konrat
AC Nummer
AC13098482
Utheses ID
34508
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |