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Insertion of modifications into proteins by semisynthesis
generating and testing of new NpuDnaE-protein constructs and expression and purification of a recombinantly expressed GPI-anchored peptide
Alanca Schmid
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
DOI
10.25365/thesis.38979
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30011.73297.168866-3
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Posttranslationale Modifikationen (PTMs) sind wichtige Prozesse in der Biologie, weshalb sie bei der Untersuchung von Proteinen immer berücksichtigt werden sollten. Da native Proteine zumeist mehrfach posttranslational modifiziert vorliegen, ist die Funktionsbestimmung einzelner PTMs schwierig. Dieses Problem kann durch die ortsspezifische Einführung von PTMs in Proteine gelöst werden. Das Prion Protein ist bekannt dafür, durch posttranslationale Umwandlung tödliche, neurologische Erkrankungen wie z.B. Creutzfeld Jakobs Krankheit auszulösen. Dabei scheint die Membranverankerung über einen GPI Anker eine wichtige Rolle zu spielen. Um die Funktionen GPI verankerter Proteine zu untersuchen, wird eine einfache und schnelle Synthesestrategie benötigt. Da die rein chemische Synthese sehr aufwendig ist, wäre ein molekularbiologischer Ansatz zu bevorzugen. Daher wurde ein Konstrukt, welches alle für eine GPI Verankerung benötigten Signalsequenzen besitzt exprimiert und unter Ausnutzung von Antigen-Antikörper Wechselwirkungen aufgereinigt. Eine eingebaute TEV Protease Erkennungssequenz ermöglicht die Freisetzung des GPI Ankers mit einem Cystein am N-terminus. Dieser Membrananker kann anschließend durch Expressed Protein Ligation (EPL) an verschiedene C-terminale Thioester enthaltene Proteine angeknüpft werden. Um rekombinant exprimierte Proteine mit einem C-terminalen Thioester zu generieren, werden Inteine verwendet. Wird das jeweilige Protein vor ein mutiertes Intein kloniert, kann die N-terminale Spaltung durch die Zugabe eine Thiols ausgelöst werden, was zur Freisetzung des Proteins mit einem C-terminalem Thioester führt. Da DnaE Inteine verschiedener Cyanobakterien bekannt für ihre schnelle Spleißkinetik und sehr gute Spaltungseffektivität sind, wurde mutierte Version des DnaE Inteins von Nostoc Punctiforme in anspruchsvolle Proteine kloniert. Die Kinetik der Thioesterbildung wurde mittels SDS-PAGE beobachtet und die Ergebnisse mit den zuvor verwendeten MxeGyrA Konstrukten verglichen.
Abstract
(Englisch)
Posttranslational modifications (PTMs) are crucial in biology since they severely influence structure, activity and localization. Therefore, while studying proteins, PTMs need to be taken into account. Since the study on isolated modifications is not possible within native, multiply modified proteins, the introduction of site specific PTMs into large proteins is an essential step for elucidating protein function. The prion protein is known to cause fatal neurological disorders such as Creutzfeldt Jakob disease by conversion into a pathogenic isoform during posttranslational modification. Thereby, membrane anchoring via a GPI anchor seems to play a crucial role. For further studies concerning GPI-anchored protein functions, an easy and fast synthesis strategy is required. Therefore, a construct containing a GPI anchoring machinery was expressed and purified using antigen-antibody interactions. By incorporating a TEV cleavage site, the GPI anchor was subsequently released containing an N terminal cysteine. The obtained membrane anchor can be attached to a C-terminal thioester containing proteins via Expressed Protein Ligation (EPL). To create recombinantly expressed proteins carrying a C terminal thioester, inteins are used. Fusing the protein of interest (POI) upstream to a mutated intein, N terminal cleavage can be induced by addition of thiols releasing the POI with the respective thioester on its C terminus. Since DnaE inteins from different cyanobacteria are known to provide extremely fast splicing kinetics and very good cleavage efficiencies, an artificially fused, mutated version of DnaE intein from Nostoc punctiforme was cloned in frame into challenging proteins. Kinetics of thioester generation were observed via SDS-PAGE and compared to the results of previously used MxeGyrA constructs.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Semisynthesis Intein GPI anchor posttranslational modofications Expressed Protein Ligation
Schlagwörter
(Deutsch)
Semisynthese Intein GPI Anker post-translationale Modifikationen
Autor*innen
Alanca Schmid
Haupttitel (Englisch)
Insertion of modifications into proteins by semisynthesis
Hauptuntertitel (Englisch)
generating and testing of new NpuDnaE-protein constructs and expression and purification of a recombinantly expressed GPI-anchored peptide
Paralleltitel (Deutsch)
Semisynthetische Einführung von Modifikationen in Proteine: Herstellung und Prüfung von neuen NpuDnaE-Protein Konstrukten und Expression und Aufreinigung eines rekombinanten GPI-verankerten Peptids
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
96 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
Klassifikationen
35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,
35 Chemie > 35.76 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße
AC Nummer
AC13098550
Utheses ID
34529
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |