Detailansicht
Molecular, structural, and in vivo analysis of the dominant plectin mutation plectin EBS-Ogna
Nevena Jaksic
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Dr.-Studium der Naturwissenschaften Molekulare Biologie
Betreuer*in
Gerhard Wiche
DOI
10.25365/thesis.39008
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29908.60193.201269-8
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Plectin, ein großes multifunktionelles Cytoskelettprotein vernetzt Intermediärfilamente
und vermittelt ihre Interaktion mit Aktinfilamenten und Mikrotubuli, den beiden anderen
Cytoskelett-Filamentsystemen. Plectin verankert auch Intermediärfilamente an strategisch
wichtigen Stellen der Zelle, wie Hemidesmosomen in basalen Keratinozyten, Costamere,
Z-Scheiben und neuromuskuläre Endplatten in Muskelzellen, der axonalen Membran von
Schwann-Zellen, fokalen Adhäsionen, Mitochondrien und dem Zellkern. Aufgrund dieser
Eigenschaften und der zusätzlichen Fähigkeit kompakte oligomere Strukturen ausbilden
zu können, wirkt Plectin Zell- und Gewebe-stabilisierend und zeichnet für die
Aufrechterhaltung der Integrität, insbesondere von Geweben die großen mechanischen
Belastung ausgesetzt sind, wie Haut, Skelettmuskel und Blutgefäße, verantwortlich.
Plectin wird in einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben exprimiert, und zwar in Form
mehrerer Proteinisoformen, die durch differentielles Spleißen alternativer erster Exons
aus einem einzigen Gen (PLEC) entstehen. Durch die Verwendung unterschiedlicher
Promotoren für die einzelnen ersten Exons kommt es zur Zelltyp-spezifischen Expression
der Isoformen.
Mutationen im Plectingen werden autosomal-rezessiv vererbt und führen zu
Epidermolysis bullosa simplex (EBS) assoziiert mit Muskeldystrophie und/oder
Myasthenie-Syndrom, Pylorusatresie, Ptosis und Ophthalmoplegie. Die einzige
autosomal-dominante Mutation im Plectingen ist als „Ogna-Mutation“ bekannt und
beruht auf einer Missense-Mutation in einer Domäne des Proteins, die in allen Isoformen
vorkommt. Träger dieser Mutation zeigen einen Phänotyp, der sich nur in der Haut
manifestiert. Diese natürlich vorkommende Mutation stellt somit ein ideales System dar,
um etwaige Haut-spezifische Funktionen von Plectin zu identifizieren und den
Pathomechanismus der Mutation auf molekularen Ebene untersuchen.
Im ersten Abschnitt meiner Dissertationsarbeit stellte ich eine („knock-in“) Mauslinie
her, bei der das Plectingen in einem der beiden Allele mit einem die Ogna-Mutation
enthaltendem Gen ersetzt wurde. Dieser Teil der Arbeit umfasst Kapitel über die
Konstruktion des Targeting-Vektors, die Züchtung, Elektroporation, und Selektion von
embryonalen Stammzellen mit nur einem mutierten Allel, die Produktion von chimären
Mäusen nach Blastozysteninjektion und den Nachweis der Keimbahntransmission. Ferner
Summary 4
werden Versuche beschrieben, welche die Expression der Mutation in verschiedenen
Mausgeweben und primären Keratinozyten bestätigen.
Im zweiten Teil der Arbeit präsentiere ich die phänotypische Charakterisierung dieser
Knock-in-Mauslinie. Als wichtigste pathologische Merkmale, fand ich deutlich erhöhte
Fragilität der Haut, und weniger, kleinere, und nicht-funktionelle Hemidesmosomen,
gekennzeichnet durch eine Störung der Verankerung von Keratinfilamenten am inneren
hemidesmosomalen Plaque. Unter Verwendung Isoform-spezifischer Antikörpern konnte
ich zeigen, dass die als P1a bekannte Plectinisoform in der Epidermis von Ogna-Mäusen
sowie daraus isolierter primärer Keratinozyten fehlt. Weitere ex-vivo-Studien mit
primären Keratinozyten zeigten, dass aus Ogna-Mäusen isolierte Keratinozyten weniger
widerstandsfähig gegen Stress (z.B. hypo-osmotischer Schock) sind, schneller migrieren
als ihre Wildtyp-Gegenstücke, und keine Integrin-Clusterbildung aufweisen. Außerdem
fand ich, dass nach transienter Expression von Wildtyp-P1a, im Gegensatz zu anderen
Isoformen, die normale Keratin-Cytoskelett-Organisation in Plectin-defizienten
Keratinozyten wieder hergestellt werden konnte. Skelett- und Herzmuskel zeigten keine
funktionellen oder strukturellen Anomalien. Diese Daten weisen eindeutig auf eine große
Bedeutung von P1a für die Struktur und Funktionalität von Hemidesmosomen hin.
Für den letzten, mehr biochemischen Teil meiner Arbeit, exprimierte ich die zentrale
Stabdomain von Plectin in Sf9-Zellen mit Hilfe rekombinanter Baculoviren. Ich konnte
zeigen, dass die Stabdomäne in der Lage ist zu dimerisieren und weitere Formen
hochgeordneter oligomerer Strukturen zu bilden. Im Vergleich zu Wildtyp-Oligomeren,
erwiesen sich die aus Ogna-mutiertem Plectn gebildeten Oligomere als weniger resistent
gegenüber Hitze und Denaturierungsmitteln wie Harnstoff. Die geringere Stabilität der
Ogna-Stabdomäne ist wahrscheinlich auf die lokale Entfaltung ihrer coiled-coil-Struktur
und die damit verbundene verminderte Sekundärstruktur-Ausbildung zurückzuführen.
Eine Suche nach Bindungspartnern der mutierten Stabdomäne offenbarte seine
Assoziation mit Serin-Proteasen.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente führten zur Entwicklung
eines neuen, die Selbstassoziation von Plectinmolekülen miteinbeziehenden
Strukturmodells für Hemidesmosomen, und sie geben Einblicke in die molekularen
Mechanismen die zur Blasenbildung der Haut bei EBS-Ogna führen.
Abstract
(Englisch)
SUMMARY
Plectin is a large multifunctional cytoskeletal protein that cross-links intermediate
filaments and mediates their interaction with actin filaments and microtubules, the other
two major cytoskeletal filament systems. Plectin also anchors intermediate filaments at
strategic cellular sites, such as hemidesmosomes in basal keratinocytes, costamers, Zdisks,
and the neuromuscular junction in muscle cells, the abaxonal membrane of
Schwann cells, focal adhesions, mitochondria, and the nucleus. Due to these functions,
and the additional ability to form compact oligomeric structures, plectin stabilizes cells
and tissues, maintaining tissue integrity, particularly of tissues subjected to great
mechanical stress, such as skin, skeletal muscle, and blood vessels. Plectin is expressed in
a wide range of cell types and tissues in form of several protein isoforms that are
generated by differential alternative first exon splicing from a single gene (PLEC). The
use of alternative first exons, endowed with their own promoters, allows for cell-type
specific expression of the isoforms.
Mutations in the plectin gene are inherited in an autosomal recessive manner and
result in epidermolysis bullosa simplex (EBS) combined with muscular dystrophy and/or
myasthenic syndrome, pyloric atresia, ptosis and ophthalmoplegia. The only autosomal
dominant mutation identified in the plectin gene, known as the “Ogna mutation”, is due to
a missense mutation in a domain of the protein common to all isoforms. Its carriers
exhibit a skin-only phenotype. The study of this naturally occurring mutation, thus
represents an ideal system, to reveal skin-specific functions of plectin, and to explain the
pathomechanism of the mutation on the molecular level.
In the first part of this thesis, I describe the generation of a mouse line carrying the
Ogna mutation. This work included the construction of a targeting vector, growing,
electroporation and selection of ES cells carrying the mutation in only one allele,
production of chimeric mice by blastocyst injection and confirmation of germ line
transmission. I also confirmed the expression of the mutation in different mouse tissues
and primary keratinocytes.
In the second part, I present the phenotypic characterization of the Ogna knock-in
mouse line. As its main pathological features, I found skin fragility, and less, smaller, and
non-functional hemidesmosomes characterized by impaired attachment of keratin
filaments to the inner hemidesmosome plaque. Using isoform-specific antibodies I could
Summary 2
show that plectin isoform P1a was missing in the skin of Ogna mice and in monolayers of
cultured primary keratinocytes. Additional ex vivo studies with primary keratinocytes
showed that keratinocytes isolated from Ogna mice are less resistant to stress (eg. hypoosmotic
shock), migrate faster that their wild-type counterparts, and fail to promote
integrin clustering. Furthermore I found that upon transient expression only wild-type P1a
was able to rescue the aberrant keratin cytoskeleton organization of plectin-null
keratinocytes. Skeletal muscle and heart showed no functional or structural abnormalities.
These data clearly established the importance of P1a for the structure and functionality of
hemidesmosomes.
In the last, more biochemical part of my thesis I expressed plectin’s rod domain in Sf9
cells using recombinant baculovirus. This enabled me to demonstrate that the plectin rod
is able to dimerize and further form highly ordered oligomeric structures. However,
compared to wild-type oligomers, rod oligomers carrying the Ogna mutation turned out to
be less resistant towards heat and denaturing agents, such as urea. As the Ogna mutation
brings about a local unfolding of the coiled-coil rod structure, its lower resistance could
be attributed to a reduced stability of plectin’s secondary structure. A search for binding
partners of the mutated rod revealed its association with serine proteases.
The work done for this thesis led to the proposal of a novel model for the structural
reinforcement/stabilization of hemidesmosomes through self-association of plectin
molecules and it provided insights into the the molecular basis of the skin blistering
disease EBS-Ogna.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Plectin EBS-Ogna
Schlagwörter
(Deutsch)
Plectin EBS-Ogna
Autor*innen
Nevena Jaksic
Haupttitel (Englisch)
Molecular, structural, and in vivo analysis of the dominant plectin mutation plectin EBS-Ogna
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
VIII, 133 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Marcel F. Jonkmann ,
Matthias Schmuth
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12675766
Utheses ID
34555
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |