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Development of a bicistronic expression system for generation of Multi-Hit transgenic mice

Irina Ivanova

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Robert Eferl

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DOI

10.25365/thesis.39074

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29870.62758.566670-7

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Entstehung von Krebs ist ein langwieriger und vielstufiger Prozess und basiert auf der Anhäufung von mehreren Mutationen (Hits) in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen. Wir haben ein Multi-Hit Mausmodell für das Untersuchen dieses vielstufigen Prozesses entwickelt. Das Modell basiert auf einer Cre-vermittelten stochastischen Aktivierung von drei Kandidaten Onkogenen. Stochastische Aktivierung führt zu einem mosaikartigen Expressionsmuster in Mausgeweben. Aus Zellen mit synergistischen Aktivierungsmustern entstehen in Folge Tumore. Die Multi-Hit Konstrukte für die Herstellung von Multi-Hit transgenen Mäusen bestehen aus drei Expressionsmodulen die von loxP Sequenzen flankiert sind. Jedes Modul wird in verkehrter Orientierung (off) kloniert und besteht aus einem Kanditatengen, einer internen Ribosomenbindestelle (IRES) und einem Reportergen. Die Module sind von heterotypischen loxP Sequenzen flankiert und die Expression wird von einem starken CAGGS Promoter reguliert. Aktivierung von Cre Recombinase in Mult-Hit transgenen Mäusen führt zu Inversion (flipping) und stochastischer Aktivierung der Module. In unserem originalen Multi-Hit Konstrukt haben wir drei mutierte Ras Gene, HrasV12S35, HrasV12G37 und HrasV12C40, verwendet. Diese Ras Mutanten aktivieren verschiedene Ras Effektor Signalwege (MAPK, RalGEF und PI3K). Die Mutanten wurden von den EYFP, dsRed oder hCD2t Reportergenen durch eine 5xGtx IRES Sequenz separiert. Das Ziel dieser Masterarbeit war die technologische Weiterentwicklung des Multi-Hit Vektor Systems. Die 5xGtx IRES Sequenz im Originalkonstrukt hat nach stochastischer Aktivierung der Ras Kanditatengene in vivo zu keiner detektierbaren Reporteraktivität geführt. Deshalb wurde die 5xGtx IRES Sequenz durch eine virale P2A Sequenz ersetzt. Außerdem wurden die originalen Reportergene gegen memEYFP, nucECFP, mCherry und die originalen Ras Effektor Mutanten gegen gebräuchlichere Mutanten für die Aktivierung von Ras Stromabwärtssignalwegen (C-RafCAAX, p110myr/H1047R, RalG23V) ausgetauscht. Die neuen Konstrukte wurden auf Expression von Kanditatengenen und Reportergenen in vitro getestet. Immunfluoreszenz von transfizierten HEK293T Zellen bestätigte Reporteraktivität. Die Fähigkeit der P2A Sequenz 5’cap unabhängige Translation zu initiieren wurde über Western blot Experimente bestätigt. Die virale P2A Sequenz hat sich als vorteilhaft gegenüber der 5xGtx IRES Sequenz erwiesen und führte zu einer effizienten Expression der Reportergene.

Abstract

(Englisch)

Cancer formation is a multistep process that develops over a long period of time and requires accumulation of several mutations (hits) in oncogenes and tumor suppressor genes. Recently, we have developed a Multi-Hit mouse model to investigate the multi-step development of tumors. The model is based on Cre-mediated stochastic activation of three candidate oncogenes. Stochastic activation results in a mosaic pattern of different activation combinations in a given tissue. Cooperating activation patterns are positively selected and give rise to cancer. Multi-Hit constructs consist of three expression modules that are flanked by loxP sites. Each module is cloned in inverted (off) orientation and comprises a candidate gene, an internal ribosomal entry site (IRES) and a reporter gene to monitor activation of modules. The modules are flanked by antiparallel heterotypic loxP sites and expression is controlled by a strong CAGGS promoter. Therefore, activation of Cre recombinase in a Multi-Hit transgenic mouse results in flipping of modules and stochastic activation. In the original Multi-Hit construct, three mutated Ras genes, HrasV12S35, HrasV12G37 or HrasV12C40, have been used as candidate genes. These Ras mutants activate different Ras downstream effector pathways (MAPK, RalGEF and PI3K). They were separated by a 5xGtx IRES sequence from EYFP, dsRed or hCD2t reporter genes. The aim of this master project was the technological improvement of the Multi-Hit vector system. The 5xGtx IRES in the original construct failed to provide expression of reporter genes after stochastic activation of Multi-Hit modules in vivo. Therefore, we replaced the 5xGtx IRES for a self-cleaving viral P2A sequence. Moreover, the original reporter genes were exchanged for memEYFP, nucECFP, mCherry and the original Ras effector mutants were replaced by more commonly used mutant genes for activation of Ras downstream effector pathways (C-RafCAAX, p110myr/H1047R, RalG23V). The new vectors were tested for expression of candidate and reporter proteins in vitro. Immunofluorescence of transfected HEK293T cells verified synthesis of reporter proteins which emitted light at different wavelengths. The capability of P2A to induce 5’cap independent translation was further confirmed by Western blot analysis. Thus the viral P2A sequence has an advantage over the originally used 5xGtx IRES and leads to efficient expression of reporter genes.

Autor*innen

Irina Ivanova

Haupttitel (Deutsch)

Development of a bicistronic expression system for generation of Multi-Hit transgenic mice

Publikationsjahr

2015

Umfangsangabe

93 Seiten Illustrationen, Diagramme

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Robert Eferl

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC12690117

Utheses ID

34612

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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