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Influence of sugar on the fat metabolism and the insulin signaling pathway in Caenorhabditis elegans
Eva Maria Mairhofer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Ernährungswissenschaften
Betreuer*in
Martina Ortbauer
DOI
10.25365/thesis.39260
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29349.77308.312761-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Hintergrund
Der Einfluss von Zucker, besonders von Fruktose, auf die menschliche Gesundheit, beispielsweise das Körpergewicht, gelangte in den letzten Jahren in den Fokus von Wissenschaft und Medien. Eine Vielzahl an Studien an Menschen und Tieren untersucht den Zusammenhang zwischen Zuckerkonsum und chronischen Krankheiten. Deren Ergebnisse sind jedoch kontrovers, weswegen es weiterer Untersuchungen bedarf. Studien an Modellorganismen, wie dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans (C. elegans), können einen wertvollen Beitrag zur Erforschung von metabolischen Effekten von Zucker leisten, weil viele essentielle Stoffwechselwege im Menschen konserviert sind.
Zucker wird hauptsächlich als Disaccharid Saccharose konsumiert. Saccharose besteht aus den beiden Monosacchariden Glukose und Fruktose, die sich bezüglich Absorption, Metabolismus in der Leber und Reaktivität unterscheiden. Diese Masterarbeit beschäftigt sich mit den Einflüssen von Glukose und Fruktose allein, sowie Saccharose und einer 50:50 Mischung aus Glukose und Fruktose auf Gene des Fettstoffwechsels (nhr-49, lpd-2, fasn-1, elo-2) und Gene (hcf-1, daf-16, sir-2.1, hsp-1) und Proteine (DAF-16, SIR-2.1) des Insulinsignalwegs von C. elegans.
Methoden
Bristol N2 (Wildtyp) C. elegans wurden auf E. coli beimpften NGM-Platten in einem 20 °C Inkubator gezüchtet. Synchronisierte Larven wurden mit unterschiedlichen Zuckerlösungen mit einer Konzentration von 5,4 % gefüttert. Die Kontrollgruppe erhielt nur die Bakterien und keinen Zucker als Futter. Die Larven lebten 50 h bei 20 °C auf den Zuckerplatten und wurden für alle Experimente verwendet. Für die Genexpressionsanalysen wurde mithilfe eines RNeasy Minikits (Qiagen) die RNA von den unterschiedlich gefütterten Würmern gereinigt und extrahiert. Vor der Amplifikation der einzelsträngigen RNA mittels RT-qPCR wurde sie mittels eines QuantiTect Reverse Transcription Kits (Qiagen) zu doppelsträngiger cDNA transkribiert. Mittels der ddCt-Methode (relative Quantifizierung) wurden die mRNA Levels von einem Gen zu den mRNA Levels desselben Gens in der Kontrollgruppe und zu den Houskeeping Genes normalisiert. Für die Western Blot Analysen wurden die Proteine der Wurmproben nach Molekulargewicht mittels SDS PAGE (Gelelektrophorese) aufgetrennt. Die Proteinextrakte wurden von dem Gel auf eine PVDF-Membran transferiert, mit 5 % Milch in PBST geblockt und mit 2 spezifischen Antikörpern inkubiert. Vor der Detektion wurde die Membran mit einem Substrat, das ein Signal an der Stelle des Zielproteins produziert, inkubiert. Das Signal wurde mittels einer Bio-Rad Chemidoc Station detektiert.
Ergebnisse
Zu einer erhöhten Expression von hcf-1 kam es nach Glukose- und Saccharosefütterung. Fruktose verringerte sie leicht. Glukose und Fruktose allein veränderten die hsp-1 Expression nicht. Wenn sie allerdings gebunden in Form von Saccharose oder in der 50:50-Mischung gegeben wurden erhöhten sie die Expression leicht, aber signifikant. Die Fütterung von Fruktose und Saccharose erhöhten den Proteingehalt von SIR-2.1. Glukose, Fruktose und Saccharose erniedrigten den DAF-16 Gehalt im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die untersuchten Gene des Fettstoffwechsels (nhr-49, lpd-2, fasn-1, elo-2) wurden durch die Fütterung von Zucker nicht in einem Ausmaß, welches ihren Einfluss auf den Stoffwechsel ändern würde, beeinflusst.
Fazit
Die verminderte hcf-1-Expression nach Fruktosefütterung lässt auf einen Einfluss von Fruktose auf den Insulinsignalweg von C. elegans schließen. Die Hemmung von DAF-16 durch hcf-1 ist demnach unter Fruktosefütterung vermindert oder abwesend. DAF-16- und SIR-2.1-Levels stimmten nicht mit erhöhten mRNA-Levels überein, was auf einen Abbau der mRNA vor der Translation in Protein hindeutet. Die hsp-1-Expression konnte nur durch eine Kombination von Fruktose und Glukose, in Form von Saccharose oder als Mischung ihrer freien Formen, beeinflusst werden. Das könnte darauf hinweisen, dass die isolierte bzw. kombinierte Aufnahme der Monosaccharide Glukose und Fruktose den Stoffwechsel von C. elegans unterschiedlich beeinflussen.
Die erzielten Ergebnisse erlauben keine Schlussfolgerungen auf einen tatsächlichen Einfluss von Zucker auf die untersuchten Fettstoffwechselwege.
Abstract
(Englisch)
Background
There is a worldwide scientific and media attention concerning potential health effects, for example overweight, of sugar, especially fructose. Various studies on humans and animals investigate the association between sugar consumption and chronic diseases. However, their findings are controversial, which indicates a need for further trials. Studies on animal models, e.g. the nematode C. elegans, can substantially contribute to investigate metabolic effects of sugars as many essential pathways in mammals are well conserved in animal models.
Sugar is consumed mainly as the disaccharide sucrose, which consists of the two monosaccharides glucose and fructose. There are differences between them, concerning their absorption, their metabolism in the liver and their reactivity. This master thesis investigated the influences of glucose and fructose alone, sucrose and a 50:50 mixture of glucose and fructose on genes of the fat metabolism (nhr-49, lpd-2, fasn-1, elo-2) and genes (hcf-1, daf-16, sir-2.1, hsp 1) and proteins (DAF-16, SIR-2.1) of the insulin signaling pathway in C. elegans.
Methods
Bristol N2 (wild type) C. elegans were grown on E. coli seeded nematode growth medium-plates in a 20 °C incubator. Synchronized larvae were fed with different kind of sugars at a concentration of 5.4%. A control group received only the bacteria and no sugar. Larvae lived on the sugar plates for 50 hours at 20 °C and were used for all experimental treatments. For gene expression analysis RNA of the different fed worms was purified and extracted using an RNeasy MiniKit (Qiagen). Before amplifying the single stranded mRNA using RT-qPCR it was transcribed to double stranded cDNA using a QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). mRNA levels of one gene were normalized to housekeeping genes and to mRNA levels of the same gene in the control group using the ddCt-method. For Western blot analysis the proteins of the worm samples were separated by molecular weight using SDS PAGE. The protein extracts from the gel were transferred onto a PVDF membrane, which was blocked with 5% milk in PBSt and incubated with 2 specific antibodies. The signal was captured using a Bio-Rad Chemidoc station, after incubating the membrane with a substrate that produces a signal corresponding to the position of the target protein.
Results
Hcf-1 expression is increased in response to glucose and sucrose. Fructose feeding led to a slight decrease. Glucose and fructose alone did not alter hsp-1 expression. When glucose and fructose were given bound in sucrose or in a 50:50 mixture the expression increased slightly but significantly. Fructose and sucrose feeding increased protein levels of SIR-2.1. Feeding of glucose, fructose and sucrose decreased DAF-16 levels compared to the control group.
Genes of the fat metabolism (nhr-49, lpd-2, fasn-1, elo-2) were not influenced by sugars in a way that would change their effects on metabolism.
Conclusion
It can be concluded that the feeding of 5.4% fructose influences the insulin signaling pathway of C. elegans by a decrease in hcf-1 expression. This indicates that under fructose alone feeding the inhibition of DAF-16 by hcf-1 is low or absent. As levels of DAF-16 and SIR-2.1 were not in consistence with elevated mRNA levels it seems that mRNA is degraded before its translation into proteins. As only the combination of fructose and glucose, either bound in sucrose or a mixture of their free forms, could influence hsp-1 expression it might be concluded that it makes a difference in the metabolism of C. elegans whether the monosaccharides glucose and fructose are ingested isolated or in combination. The conducted results do not allow to draw a conclusion concerning an actual influence of sugars on fat metabolism in the examined pathways.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Caenorhabditis elegans sugar fructose fat metabolism insulin signaling pathway
Schlagwörter
(Deutsch)
Caenorhabditis elegans Zucker Fruktose Fettmetabolismus Insulin Signalweg
Autor*innen
Eva Maria Mairhofer
Haupttitel (Englisch)
Influence of sugar on the fat metabolism and the insulin signaling pathway in Caenorhabditis elegans
Paralleltitel (Deutsch)
Einfluss von Zucker auf den Fettmetabolisum und den Insulin Signalweg in Caenorhabditis elegans
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
83 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Martina Ortbauer
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC12407859
Utheses ID
34781
Studienkennzahl
UA | 066 | 838 | |