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Investigating interactions between von Willebrand factor and DNA using single molecule force spectroscopy
Verena Pfarrhofer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Peter Hinterdorfer
DOI
10.25365/thesis.39419
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30009.53106.284165-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der von Willebrand Faktor (vWF) ist ein Protein im Blut welches eine lebenswichtige Rolle in unserem primären Blutgerinnungssystem spielt. Um ungewollten Blutfluss stoppen zu können, bildet der vWF ein dichtes Netzwerk mit seinen Bindungspartnern (zB. Kollagen und Blutplättchen) und verankert dieses im verletzten Blutgefäß.
Vor kurzem wurde herausgefunden, dass der vWF auch mit DNA interagieren kann. DNA ist bekannt als wichtigstes Molekül in der Biologie, da sie die Trägerin der Erbinformation ist. Im Blutstrom kann DNA als sogenannte „neutrophil extracellular traps“, also von Immunzellen fabrizierte Fallen aus DNA, vorliegen. Diese „traps“ haben die Aufgabe eindringende Pathogene wie Viren oder Bakterien zu erfassen. Die Interaktion von vWF und DNA verdeutlicht dass der vWF anscheinend auch eine Rolle in Entzündungsprozessen spielt.
Die Bindungsstelle für DNA liegt anscheinend in der A1 Domäne des vWF. Außerdem bindet vWF DNA abhängig von Ristocetin. Ristocetin ist ein Antibiotikum welches die Interaktion der beiden Bindungspartner ohne Scherstress ermöglichen soll. Neben vWF Wildtyp-Konstrukten wurden auch zwei Mutationen (R1308C und A1461D) der A1 Domäne untersucht.
Um den Bindungseigenschaften zwischen DNA und vWF auf den Grund zu gehen, wurden Kraftspektroskopie-Experimente mit sechs verschiedenen vWF Konstrukten durchgeführt. Die Evaluierung der Bindungsanzahlen der verschiedenen Konstrukte wurde unter anderem im Beisein von Ristocetin durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass A1 die einzige Domäne war welche von Ristocetin profitierte, bei allen anderen schien es eher einen negativen Effekt zu haben. Auch „loading rate dependences“ wurden für alle sechs Konstrukte gemessen, um die Bindungsdynamik genauer untersuchen zu können. So wurden die Energiebarrieren Xβ und die Dissoziationskonstanten koff (und somit in weiterer Folge auch die Lebenszeiten τ) berechnet. Dies sind die wichtigsten Parameter um biologische Interaktionen beschreiben zu können. Bindungsanzahlen und Lebenszeiten konnten zum Beispiel verglichen werden, was zeigte, dass diese Werte nicht unbedingt zusammenhängen müssen.
Zusätzlich zu den Kraftspektroskopie-Experimenten war auch Imaging der verwendeten λ-DNA ein Teil dieser Masterarbeit. Dies stellte sich leider als nicht ganz so einfach dar, sodass verschiedene Inkubationskonditionen getestet werden mussten um ein passendes Protokoll zu finden.
Letztendlich wurden aber passende Konditionen gefunden, welche es ermöglichten, DNA Stränge mit hoher Auflösung zu imagen.
Abstract
(Englisch)
Von Willebrand factor (vWF) is a protein in blood that plays an essential role in our primary hemostasis. By forming a mesh and anchoring activated blood platelets to injured vessel walls, continuous bleeding can be prevented in a fast way, as vWF contains binding sites for e.g. platelets and collagen.
Recently, also binding of vWF to DNA was revealed. DNA is the central molecule in biology, as it is the carrier of the genetic information. In the bloodstream, DNA may be present as neutrophil extracellular traps. Those traps are produced by immune cells to trap and kill invading microorganisms, like viruses and bacteria. The interaction between vWF and DNA suggests that vWF, next to its huge importance in hemostasis, may also play a role in inflammatory responses.
VWF domain A1 was reported to be the binding domain for DNA within vWF. Further, vWF binds to DNA in a ristocetin dependent manner.
Ristocetin is an antibiotic which is thought to mimic shear flow conditions normally present in the blood stream, and therefore vWF-DNA interaction is possible without the presence of shear flow. Besides the vWF wildtype constructs, also two mutations (R1308C and A1461D) in the vWF A1 domain were investigated.
To investigate the interactions between vWF and DNA, force spectroscopy experiments were carried out with six different vWF constructs. Ristocetin was used to test the binding behaviors of the different vWF constructs to DNA. Here it was shown that vWF A1 domain is the only construct which is dependent on ristocetin for DNA binding. All other constructs were able to interact without its presence. The presence of ristocetin might even disturb the interactions of the other domains and DNA. Loading rate dependence measurements were performed for each of the six constructs to reveal the dynamics behind the interactions. In this way, the energy barrier Xβ and the dissociation constant koff (and subsequently the bond life time τ), which are very important parameters for describing biological interactions, could be determined.
Bond lifetimes were for example compared to binding probabilities and it turned out that a high binding probability does not necessarily correlate with a long lifetime.
To characterize the λ-DNA used in this study, AFM imaging was another important part of this thesis. As DNA imaging turned out to be quite a challenge, different incubation conditions were tested to find an appropriate protocol for DNA imaging. In the end, we succeeded in imaging λ-DNA strands with a high resolution.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
von Willebrand factor DNA force spectroscopy atomic force microscopy
Schlagwörter
(Deutsch)
von Willebrand Faktor DNA Kraftspektroskopie Rasterkraftmikroskopie
Autor*innen
Verena Pfarrhofer
Haupttitel (Englisch)
Investigating interactions between von Willebrand factor and DNA using single molecule force spectroscopy
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchung der Interaktionen zwischen von Willebrand Faktor und DNA mittels Einzelmolekül-Kraftspektroskopie
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
III, 63, IV-X Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Peter Hinterdorfer
AC Nummer
AC12737959
Utheses ID
34914
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |