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Synthese von Peptid-Oligonukleotid-Konjugate über eine 2'-Disulfidbrücke eines modifizierten Uridinbausteins

Sabine Kalchgruber

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Johannes Winkler

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DOI

10.25365/thesis.39669

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29869.19270.421063-1

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Tatsache, dass kurze RNA und DNA Oligonukleotide mit einer Ziel-RNA inter-agieren und somit selektiv auf die Genexpression wirken können, ist heute anerkannter wissenschaftlicher Konsens. Aus diesem Grund sind Antisense Oligonukleotide, mit deren zur mRNA komplementären Basensequenz, in den Fokus der Arzneimittelforschung gerückt. Im Gegensatz zu klassischen Therapeutika, welche überwiegend die Funktion von Proteinen hemmen, sind diese in der Lage die Biosynthese von Proteinen zu verhindern und somit selektiv die Proteinherstellung zu blockieren. Damit wurde ein neuer Ansatz für die Erforschung und Entwicklung entsprechender Therapeutika geschaffen. Besonders interessant ist der Einsatz von Antisense Wirkstoffen bei genetischen und viralen Erkrankungen als auch in der Krebstherapie. Der große Erfolg blieb bis dato aber aus, da Punkte wie der Abbau durch Enzyme, der Transport zu den Zielzellen, die Halbwertszeit und die, mit der unspezifischen Bindung einhergehenden, Nebenwirkungen noch ein großes Problem darstellen. All diese Probleme sollen durch die Entwicklung einer neuen Generation von AONs verringert werden. So können durch verschiedene Modifikationen und Konjugate die Eigenschaften der Therapeutika verbessert werden. Beispielsweise führt die Konjugation mit Peptiden zu einer gesteigerten Zellaufnahme und kann die Spezifität für die Zielzellen erhöhen. Das Ziel dieser Diplomarbeit war die Synthese einer solchen Peptidkonjugation. Die Besonderheit dieser liegt in den verbesserten Eigenschaften hinsichtlich Spezifität und Zellaufnahme, wobei die Auswahl des Linkers von entscheidender Bedeutung war. So kann durch die Verwendung eines stabilen, geschützen Thiols als Linker das Peptid über eine Disulfidbrücke gekoppelt werden. Die labile Disulfidverknüpfung soll eine anschließende Spaltung im Endosom ermöglichen. Dazu erfolgte die Synthese des modifizierten Nukleotidbausteins. Eine 2'-Thiolmodifikation des Uridins ermöglichte später eine kovalente Bindung der Pep-tide. Die Überprüfung der Reaktions- und Aufreinigungsschritte erfolgte mittels DC, 1H-NMR, 13C-NMR und Gelelektrophorese. Der entsprechende Baustein wurde anschließend mit Standard-Festphasensynthese in ein Oligonukleotid eingebaut. Nach der Abspaltung, Entschützung und Aufreinigung der Oligonukleotide wurden basische, zellpenetrierende Peptide an die modifizierten Oligonukleotide gekoppelt. Die Synthese des Nukleotids und auch die Herstellung der Peptidkonjugate konnte erfolgreich nachgewiesen werden.

Abstract

(Englisch)

Today it is commonly known that short RNA and DNA oligonucleotides are able to interact with a target-RNA. In this way they can affect selectively gene expression. For this reason antisense oligonucleotides, with their base sequence complementary to the mRNA, have been in the focus of drug research for quite some time. In contrast to conventional pharmaceuticals which inhibit predominantly the activity of proteins, antisense oligonucleotides stop the biosynthesis of proteins and thus the selective protein production. For this reason, a new approach was developed for the investigation and development of matching therapeutics. Especially interesting is their use for genetic and viral diseases and their usage for cancer therapies. But the limited use of the previous synthesized oligonucleotides prevented a big breakthrough so far. The side effects caused by the unspecific bond and the reduction caused by enzymes, together with inefficient transport to the target cells plus a short half-life period, constitute specific problems. The development of a new generation of oligonucleotides try to reduce this problems. Through different modifications and conjugations they will enhance the characteristics of this therapeutics. The conjugation with peptides, for example, causes an increased cell intake. Moreover the specificity for the target cells will increase. The aim of this diploma thesis was the synthesis of such peptide conjugates. The exceptionality of this compound is the improved characteristics regarding the cell uptake and the cell specificity. The selection of the linker is essential. The peptide can be linked through a disulfide bond, using with a stable and protected thiol as linker precursor. Afterwards the splitting takes place in the cell without any problems. First the modified nucleotide building block was synthesized. The 2'-modified uridine enabled the generation of a covalent bond with the peptides. The validation of the reaction and the purification was done by DC, 1H-NMR, 13C-NMR and gel electrophoresis. Afterwards the synthesized building block was incorporated in an oligonucleotide through solid-phase synthesis. After deprotection and purification of the oligonucleotides, cationic cell penetrating peptides were linked with the modified oligonucleotides. In conclusion, procedures for syntheses of the nucleotide, the oligonucleotides and conjugations with the peptides were successfully established.

Autor*innen

Sabine Kalchgruber

Haupttitel (Deutsch)

Synthese von Peptid-Oligonukleotid-Konjugate über eine 2'-Disulfidbrücke eines modifizierten Uridinbausteins

Publikationsjahr

2015

Umfangsangabe

49 Seiten : Illustrationen

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Johannes Winkler

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

AC Nummer

AC12727491

Utheses ID

35136

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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Schlagwörter