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Light sheet microscopy of cleared mouse brains combined with immunohistochemistry.
Marko Pende
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Mikrobiologie und Immunbiologie
Betreuer*in
Hans Ulrich Dodt
DOI
10.25365/thesis.39732
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30380.36408.675763-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In den letzten Jahren gab es sehr große Fortschritte in der "light sheet microscopy" und optischen Klärungsmethoden von undurchsichtigem Gewebe. Auf der einen Seite wurde das "light sheet" homogener und dünner als ein µm, was eine hohe Auflösung in der z-Achse ermöglich, und auf der anderen Seite stabilisieren neue Klärungsmethoden die Proben besser und entfernen lichtstreuende Quellen effizienter.
Zusätzlich wurden kürzlich Objektive mit großem Arbeitsabstand und einer hohen numerischen Apertur und neue Refraktionsindex-(RI)-anpassende Chemikalien, die die Transparenz des Gewebes und das Verhältnis zwischen Signal und Hintergrund für mehrere Monate konservieren, entwickelt. Dies ermöglicht schnelle 3D-Rekonstruktion von großen Proben mit einer sehr hohen Auflösung und weniger Verlust von transgenen Signalen.
Mit der Entwicklung der zuvor erwähnten Innovationen rückte das Gebiet der Immunohistochemischen (IHC) Protokole für große Gewebe und das Visualisieren von mit Antikörpern gefärbten Strukturen in diesen Geweben in den Fokus des Interesses.
In dieser Arbeit evaluiere ich verschiedene optische Klärungsmethoden in der Kombination mit diversen Protokollen für Immunfärbung und enthülle dabei die Notwendigkeit für weitere Verbesserung, was die Inkubationszeit und die Färbegradienten der Antikörper angeht.
Weiterst habe ich die Klärungsmethode namens CLRITY optimiert, indem ich, das Entfernen von lichtstreuenden Molekülen verbessert und ein neues RI-angleichendes Mittel namens BrainClear verwendet habe. Dabei habe ich die Bearbeitungszeit der Proben um die Hälfte reduziert und den Erhalt des Grünen Fluoreszenz Proteins (GFP)-Signals gesteigert.
Abstract
(Englisch)
In recent years light-sheet microscopy and tissue clearing techniques evolved quite rapidly. On one hand the light sheets became more homogeneous and thinner than one µm, which allows high resolution in the z-axis. On the other hand new clearing techniques stabilize the specimens and remove light scattering sources more efficiently.
In addition lately developed objectives with long working distances and high numerical apertures (NA) and new refraction index (RI) matching chemicals, that preserve the transparency of the tissue and the signal to background ratio for many months, enable fast 3D reconstruction of large specimens with high resolution and less transgenic signal loss.
With the development of the afore mentioned innovations, immunohistochemical (IHC) protocols for large specimens and the visualization of antibody labeled structures within thick intact tissues in three dimensions became an area of focus.
Here I evaluated diverse available clearing techniques in combination with different immunolabeling protocols and thereby showing the necessity of further improvement regarding incubation time and labeling gradients of the antibodies.
Further, I improved the clearing technique termed CLARITY by optimizing the removal of light scattering molecules and by using anew RI matching agent called BrainClear. Thereby the sample processing time was reduced by half and we were able to enhance the preservation of the green fluorescent protein (GFP)- signal.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Light sheet microscopy CLARITY immunohistochemistrie
Schlagwörter
(Deutsch)
Light sheet mikroskopie CLARITY immunohistochemistrie
Autor*innen
Marko Pende
Haupttitel (Englisch)
Light sheet microscopy of cleared mouse brains combined with immunohistochemistry.
Paralleltitel (Deutsch)
Light sheet microscopy von geklärten Mäusehirnen in kombination mit immunohistochemistry
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
69 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Hans Ulrich Dodt
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC13008392
Utheses ID
35194
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |