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Molecular response of the protozoan parasite Entamoeba histolytica to fructose as an alternative energy source and metronidazole treatment
Julia Matt
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Biologie)
Betreuer*in
Matthias Horn
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30337.84182.385059-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der im menschlichen Verdauungstrakt lebende Erreger Entamoeba histolytica ist die Ursache für invasive Amöbiasis, von der weltweit Millionen von Menschen betroffen sind. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene metabolische Stressbedingungen in Amöben analysiert, wobei eine dieser Stressbedingungen die Nährstoffversorgung der Amöben betrifft. In dieser ersten Studie wurde gezeigt, dass die Trophozoiten sich ohne Probleme an ein Kulturmedium anpassen können, das statt des Standardzuckers Glukose, Fruktose als Alternative enthält. Daher kann Fruktose als alternative Energiequelle dienen, wenn Glukose nicht zur Verfügung steht. Da die parasiteneigenen Hexokinasen Fruktose nicht phosphorylieren können, ist eine funktionelle Fruktokinase notwendig, um die Fruktose der Glykolyse zuzuführen. Daher wurde die E. histolytica Fruktokinase, die Fruktokinasen aus Bakterien ähnelt, kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Das rekombinante Enzym phosphorylierte Fruktose und Mannose, nicht aber Glukose oder Galaktose. Es zeigte sich eine magnesiumabhängige Fruktose 6-Kinase Aktivität und die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie ergab eine zytoplasmatische Verteilung in den Amöben. Die Expression der Fruktokinase mRNA verdoppelte sich ungefähr in den Amöben, die in ein Fruktosemedium transferiert worden waren. Obwohl diese Hochregulierung der mRNA eher gering ausfiel, ist diese Studie ein Beispiel dafür, dass ein E. histolytica Gen, das sehr wahrscheinlich durch lateralen Gentransfer von Bakterien gewonnen wurde, eine wichtige regulierte metabolische Funktion haben kann.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, wie sich Stress, der durch die Behandlung der Trophozoiten mit Metronidazol ausgelöst wird, auf die Amöben auswirkt. Metronidazol wird als Standardmedikament für die Behandlung von Amöbenruhr verwendet, allerdings ist dessen Funktionsweise noch nicht restlos geklärt. Ein Aspekt betrifft den DNA Abbau in diesem Parasiten, der mit TUNEL Experimenten von Metronidazol-behandelten Amöben nachgewiesen wurde. Eine Hypothese ist, dass dieser Abbau der DNA enzymatisch durch amöbeneigene DNasen ausgelöst wird und nicht chemisch durch Metaboliten von Metronidazol. Nachdem gezeigt werden konnte, dass in E. histolytica Extrakten DNase Aktivität vorhanden ist, wurde eine Datenbanksuche durchgeführt. Es wurden allerdings keine Homologen für Endonuklease G, Caspase-abhängige DNase oder DNase I und II gefunden. Es konnte jedoch ein Homologes einer ursprünglich in Bakterien gefundenen TatD Nuklease identifiziert werden. TatD soll eine Rolle beim programmierten Zelltod in Trypanosomen spielen und wurde bei verschiedenen Organismen als apoptotische Nuklease charakterisiert. Daher wurde das E. histolytica Gen kloniert, TatD dann mit einem Histidin-Tag in E. coli exprimiert und mit klassischer Metallchelatchromatographie gereinigt. Zu Beginn wurde eine Magnesium-abhängige DNase Aktivität beobachtet. Die quantitative RT-PCR zeigte jedoch eine Herunterregulierung der TatD mRNA nach der Behandlung der Amöben mit Metronidazol. Das Mutieren von konservierten Resten in TatD ergab keine großen Aktivitätsänderungen, die eigentlich zu erwarten gewesen wären. Darüber hinaus wurde ein zweiter Reinigungsschritt in Form von Kationenaustauschchromatographie durchgeführt, wobei keine Anreicherung der DNase Aktivität beobachtet werden konnte. Weiters wurde auch eine DNase Aktivität bei der rekombinanten Fruktokinase festgestellt, die ebenfalls mit Metallchelatchromatographie gereinigt worden war. Daher ist anzunehmen, dass eine Kontamination der Präparationen mit E. coli DNasen die Ursache für die zuerst beobachtete Aktivität war. Es ist also eher unwahrscheinlich, dass das E. histolytica TatD wirklich eine DNase ist, was im Gegensatz dazu steht, was TatD Studien bei anderen verwandten Arten gezeigt haben. Auch in silico Strukturanalysen des Proteins ergaben keine einfachen Lösungen für dieses Problem. Um die Funktion von TatD in E. histolytica zu klären, sind daher weitere Experimente notwendig. So könnten Präparationen, die frei von E. coli DNasen sind, dabei helfen, Antworten zu finden.
Im Gegensatz zu dem TatD Protein zeigten zwei DNA Reparaturnukleasen und die LINE (long interspersed element) Endonuklease eine bis zu 2,5-fache Hochregulierung der mRNA nach einer 4-stündigen Behandlung mit Metronidazol. Diese Endonukleasen könnten beim Abbau der Amöben-DNA nach Metronidazolbehandlung auch eine Rolle spielen.
In dieser Arbeit wurden mit der E. histolytica Fruktokinase und dem TatD Protein zwei interessante Proteine charakterisiert. Leider konnte bisher keine Nuklease, die beim Abbau der DNA in Amöben nach der Behandlung mit Metronidazol involviert ist, identifiziert werden. TatD erschien am Anfang als ein sehr guter Kandidat für diese Aufgabe, allerdings sprechen die bisherigen Ergebnisse eher dagegen, dass TatD eine DNase ist.
Abstract
(Englisch)
The human enteric parasite Entamoeba histolytica is the cause of invasive amoebiasis and affects millions of people worldwide. In this thesis, two different metabolic stress conditions in E. histolytica were investigated. One stress condition the amoebae have to deal with is the variation of nutrients. In the first study, it was shown that the trophozoites can easily adapt from medium containing glucose, which is the standard carbohydrate component in the culture medium, to medium containing fructose instead. Therefore, fructose can serve as an alternative energy source for the parasite if glucose is not available. To enter fructose into the glycolytic pathway, a fructokinase is essential, as the parasite’s hexokinases are not able to perform this function. Thus, the E. histolytica fructokinase, a bacterial-type sugar kinase, was cloned and expressed in Escherichia coli. The recombinant fructokinase phosphorylated fructose and mannose, but not glucose or galactose, and showed a magnesium-dependent fructose 6-kinase activity. Confocal immunofluorescence microscopy revealed a cytoplasmic distribution in the amoebae, and the fructokinase mRNA was up-regulated about two-fold in amoebae shifted to a fructose culture medium. Although it was only a modest mRNA up-regulation, this study provided an example, that an E. histolytica gene, which was probably acquired by lateral transfer from bacteria, can have a major regulated metabolic function in the amoebae.
In the second part of this thesis, the focus was directed to stress triggered by the treatment of E. histolytica trophozoites with metronidazole. This is the gold standard drug to treat amoebiasis, but its mode of action is not understood completely. One aspect is the DNA degradation in the parasite, which was shown by TUNEL assays of metronidazole-treated amoebae. It was hypothesized that the DNA damage is not caused chemically by metronidazole metabolites, but enzymatically by the parasite’s DNases. After showing that E. histolytica extracts had DNase activity, the databases were searched, but no homologs of endonuclease G, caspase-dependent DNase, or DNases I or II were found. However, a homolog of a TatD nuclease, which was discovered in bacteria first, was identified. TatD was implicated in programmed cell death of trypanosomes and was characterized as an apoptotic nuclease in several other organisms. Therefore, the E. histolytica gene was cloned, and TatD was expressed in E. coli with a histidine tag and purified by standard metal chelate chromatography. A magnesium-dependent DNase activity was observed at first. Quantitative RT-PCR showed a down-regulation of the TatD mRNA after metronidazole treatment and site-directed mutagenesis of conserved residues in TatD failed to reveal large changes in activity. Moreover, a second purification step by cation exchange chromatography was performed, but no enrichment of DNase activity was observed. Then we observed DNase activity in recombinant fructokinase prepared by metal chelate affinity chromatography as well. Therefore, a contamination of these preparations with E. coli DNases was most likely.
Taken together, it is highly doubtful that the E. histolytica TatD really is a DNase, which stands in contrast to what has been found in other related organisms. Structural in silico analysis of the protein revealed no easy solution for this problem and more work needs to be done to answer the question of the function of the amoebic TatD. Further experiments to generate preparations free of E. coli nuclease contaminants are needed, which could provide answers to this question in the future.
In contrast to the TatD protein, two DNA repair nucleases and an endonuclease encoded in a long interspersed element (LINE) were up-regulated up to 2.5-fold on the mRNA level after four hours metronidazole treatment. These endonucleases could be other candidates for an involvement in DNA fragmentation in amoebae upon metronidazole treatment.
With the amoebic fructokinase and the TatD protein, two interesting proteins were characterized in this thesis. Unfortunately, the identification of an E. histolytica nuclease implicated in DNA damage after metronidazole treatment was not successful so far. The TatD protein appeared to be an interesting candidate at first, however, most likely, it does not possess any DNase activity.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Entamoeba histolytica glucose fructose fructokinase stress response alternative energy source metronidazole TatD DNase DNA damage
Schlagwörter
(Deutsch)
Entamoeba histolytica Glukose Fruktose Fruktokinase Stressantwort alternative Energiequelle Metronidazol TatD DNase DNA-Abbau
Autor*innen
Julia Matt
Haupttitel (Englisch)
Molecular response of the protozoan parasite Entamoeba histolytica to fructose as an alternative energy source and metronidazole treatment
Paralleltitel (Deutsch)
Molekulare Antwort des einzelligen Parasiten Entamoeba histolytica auf Fruktose als alternative Energiequelle und Metronidazol-Behandlung
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
124 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Iris Bruchhaus ,
Graham Clark
AC Nummer
AC12713281
Utheses ID
35470
Studienkennzahl
UA | 094 | 437 | |