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Establishment of a Split-LUX Assay to Determine Protein Interaction of the BMP-Receptor mAlk2R206H (FOP Mutant) with the Rapamycin-Associated Protein FKBP12

Sandra Kronimus

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Ernst Müllner

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DOI

10.25365/thesis.40068

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29163.14389.328155-9

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) ist eine verheerende und bisher unheilbare Krankheit, die durch verschiedene Mutationen, lokalisiert in dem BMP (bone morphogenic protein) Rezeptor mAlk2, verursacht wird. Diese Arbeit fokussiert auf eine Arginin/Histidin Substitution an Position 206 in der GS (Glycin-Serin-Motif) Domäne des mAlk2 Rezeptors, welche zu heterotropher Ossifikation führt. Aufgrund dieser Mutation ist die Hemmung des Rezeptors drastisch beeinträchtig. Dies führt im Folgenden zu einer konstitutiven Aktivität des mAlk2 Rezeptors und im Weiteren zu einer dauerhaften BMP Signalweiterleitung. Um eine Heilung, oder realistischer, eine Verlangsamung des Krankheitsverlaufs zu erzielen, ist ein tiefgehendes Verständnis der Ursache, welche den Rezeptor in einen konstant aktiven Zustand versetzt, essentiell. In der vorliegenden Arbeit wird die Etablierung eines Proteinkomplemetationssystems (PCA), basierend auf der Reassemblierung von Luciferasefragmenten, beschrieben. Die Entwicklung, und die darauffolgende Optimierung, wurde anhand eines Rapamycin-induzierbaren Heterodimerisationsansatzes, im Speziellen FRB (FKBP-rapamycin binding domain of FRAP) und FKBP12 (FK506 binding protein 12), durchgeführt, in dem jeweils das N- beziehungsweise C-terminale Fragment einer Luziferase an das entsprechende Protein fusioniert wurde. Auf dieser Methode basierend, wurde die Wechselwirkung der FOP Mutante (mAlk2R206H) und dessen Wildtypinhibitor FKBP12, als auch die Interaktion von wildtyp mAlk2 sowie wildtyp mAlk3 mit FKBP12 untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten, dass die hemmende Wirkung von FKBP12 auf mAlk2R206H trotz nachzuweisender Interaktion verringert ist. Im Vergleich dazu ist eine stärkere Interaktion von mAlk2wt und mAlk3wt mit FKBP12, wie erwartet, nachzuweisen, und lässt daher auf eine stärkere Inhibierung schließen. Dies konnte durch die Reassemblierung der Luziferasefragmente gezeigt werden. Die hier aufgezeigten Resultate liefern neue Erkenntnisse, Proteininteraktionen kostengünstig und relativ einfach nachzuweisen. Im Übrigen wird veranschaulicht, dass dringende Notwendigkeit besteht, weitere Untersuchungen bezüglich der Wechselwirkung der FOP Mutante mAlk2R206H mit dessen Interaktionspartner FKBP12 durchzuführen.

Abstract

(Englisch)

Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) is a devastating disease caused by various mutations in the BMP receptor mAlk2, which leads to heterotopic ossification. The mutation this thesis is focusing on is an arginine to histidine substitution on position 206 in the GS (glycine-serine-motif) domain of the mAlk2 receptor. Due to this mutation, the receptors inhibition is drastically altered, leading to constitutive activity and permanently activated BMP (bone morphogenic protein) signaling, which consequently leads to pathological bone cell differentiation. Finding a cure for this disease or a way to decelerate its progression, while gaining an understanding of its cause, is crucial. In this thesis, a protein complementation system (PCA) based on split-luciferase reassembling is established. To develop and further optimize a split-luciferase assay, a rapamycin inducible hetero-dimerization approach namely FRB (FKBP-rapamycin binding domain of FRAP) and FKBP12 (FK506 binding protein 12), fused to N- and C-terminal fragments of a luciferase, respectively, is used. Based on this method the interaction of the FOP mutant receptor (mAlk2R206H) with it´s wild type inhibitor FKBP12 and interactions of wild type mAlk2 as well as wild type mAlk3 with FKBP12 are examined. This work suggests, that mAlk2R206H inhibition by FKBP12 is weakened whereas the interaction of mAlk2wt as well as mAlk3wt can be observed by reassembling of the luciferase fragments fused to the receptors and inhibitor. These results provide novel insight into an approach that is cheap and easy to apply to determine protein-protein interactions and highlight the need of further investigation of the interaction of the FOP mutant mAlk2R206H and its interaction partner FKBP12.

Autor*innen

Sandra Kronimus

Haupttitel (Englisch)

Establishment of a Split-LUX Assay to Determine Protein Interaction of the BMP-Receptor mAlk2R206H (FOP Mutant) with the Rapamycin-Associated Protein FKBP12

Paralleltitel (Deutsch)

Entwicklung eines Split-LUX Essays zur Bestimmung der Proteininteraktion des BMP-Rezeptors mAlk2R206H (FOP Mutante) mit dem Rapamycin-assozierten Protein FKBP12

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

XXIV, 73 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Ernst Müllner

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC13041212

Utheses ID

35493

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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