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A zebrafish model of Letm1 and Letm2 deficiency
Stefan Hajny
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Karin Nowikovsky
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29459.61022.369653-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Wolf Hirschhorn Syndrom (WHS) ist eine schwerwiegende Gendeletionskrankheit, assoziiert mit einer Vielzahl an Symptomen. Verschiedene Studien haben demonstriert, dass WHS Patienten mit epileptischen Anfällen eine LETM1 haploinsuffizienz aufweisen. Das leucine zipper-EF-hand containing transmembrane 1 (LETM1) Protein ist in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert und zeichnet sich besonders durch hohe evolutionäre Konservierung aus. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass LETM1 einen wichtigen Bestandteil der mitochondrialen Kalium Homöostase ausmacht, woraus sich die Assoziation mit Potassium/Proton-Exchanger Komplex ergibt. Knock-down oder Knock-out des letm1 Gens in verschiedenen Modellsystemen zeigte eine temporäre Wachstumsretadierung und einen geschwollenen mitochondrialen Phänotyp, zusammen mit Mitophagie und Zelltod. Während weitere Versuche in der Fruchtfliege eine erhöhte Trägheit in Letm1 defizienten Tieren offenbarten, zeigten ähnliche Experimente in Mäusen kein auffallendes Verhaltensmuster. Allerdings konnten längere und häufiger auftretende Krampfanfälle duch Injektion von konvulsiven Substanzen in Letm1 defizienten Mäusen beobachtet werden.
Nahezu alle sequenzierten eukaryontischen Genome kodieren des weiteren ein LETM1 ähnliche Protein: LETM2. Sequenzvergleiche zeigten, dass diverse LETM1 Proteindomänen auch in LETM2 auftreten. Allerdings ist die Funktionen des LETM2 Proteins unbekannt.
Die hier beschriebene Studie befasste sich mit der Analyse von letm1 und letm2 in Zebrafischen und humanen Zellen. Sequenzvergleiche und eine phylogenetische Analyse enthüllten ein hohes Maß an evolutionärer Konservierung in den untersuchten Spezies. Besonders auffallend waren hierbei die hoch konservierten Transmembran- und Calciumbindenden Proteindomänen. Visualisierung (In situ Hybridisierung) und Quantifizierung (qPCR) der letm1 und letm2 Genexpression in Zebrafischen wurden des weiteren durchgeführt um ein spezifisches Expressionsmuster zu erhalten. Basierend auf der visuellen Methode kann schlussgefolgert werden, dass sowohl letm1 als auch letm2 ubiquitär in Zebrafischlarven und adulten Gehirnen exprimiert wird. Die Quantifizierung der letm1 Transkripte in Fischlarven zeigte im Kopf ein höheres Vorkommen als im restlichen Körper. Im Gegensatz dazu zeigten die Resultate von letm2 keine signifikanten Unterschiede. Es wurde außerdem festgestellt, dass obwohl die letm2 Expression in den Larven marginal höher als die von letm1 war, die adulte Tiere eine deutlich ausgeprägtere letm1 Expressionsrate aufwiesen.
Im Rahmen der Studie wurde mittels der TALEN und CRISPR/Cas9 Methode sowohl eine letm1 als auch letm2 haploinsuffiziente Zebrafischlinie etabliert. Diese Modellsysteme dienen als wichtige Grundlage zur Untersuchung verschiedener Aspekte von Letm1 und Letm2.
Anschließende Lokomotor Analysen in den generierten letm1+/- Fischen zeigten allerdings kein ungewöhnliches Schwimmverhalten. Des weiteren wurden Lokalisationsstudien durchgeführt. Hierfür wurden zwei Sets an Expressionsvektoren mit einer fluoreszenz markierten Fisch-letm1 oder Fisch-letm2 Sequenz hergestellt und in Zebrafischembryonen beziehungsweise HeLa Zellen transferiert. Mittels Konfokalmikroskopie konnte anschließend die explizite, mitochondriale Lokalisation von Letm1 und Letm2 im Zebrafisch und in den humanen Zellen festgestellt werden.
Abstract
(Englisch)
Wolf Hirschhorn Syndrome (WHS) is severe gene deletion syndrome associated with a wide range of related symptoms. Different studies showed that WHS patients with seizures are LETM1 haploinsufficient. The leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1 (LETM1) is an evolutionary conserved and nucleus encoded mitochondrial protein located in the inner membrane. Recent studies showed that LETM1 regulates the mitochondrial potassium homeostasis and is therefore a factor of the Potassium/Proton-Exchanger (KHE) complex. Disruption of LETM1 in various model systems revealed a temporary growth retardation and mitochondrial swelling, associated with mitophagy and cell death. Furthermore, while DmLetm1 deficient flies are less mobile than the controls, mice do not show any characteristic phenotype. However, injection of a convulsant substance induced prolonged and higher frequent seizures in the mutant rodents, compared to healthy specimens.
Besides LETM1, most eukaryotes also encode a LETM1-like protein, termed LETM2. Sequence alignments showed that LETM2 shares various domains with LETM1. However, the role and function of the novel protein is still elusive.
The current study was addressed to investigate several aspects of LETM1 and LETM2 in the zebrafish and human cells. Sequence alignments and a phylogenetic analysis of the studied proteins revealed their highly conservation throughout the animal kingdom. Furthermore, it was also found that especially the transmembrane and calcium binding domains are very well preserved. Visualization (In situ hybridization) and quantification (qPCR) of the letm1 and letm2 gene expression in larval and adult tissue samples was further conducted to determine their expression pattern in the zebrafish. The first method revealed a ubiquitous expression of both investigated proteins in larvae and adult fish brains. Quantification of the letm1 expression levels showed a higher abundance in the head than in the residual body during development. However, the levels of letm2 stayed almost even. Interestingly, while the letm2 expression is modestly higher during some developmental stages, adult fish clearly display higher levels of letm1 in all observed organs.
A novel letm1 and letm2 haploinsufficient zebrafish strain was generated by means of the TALEN and CRISPR/Cas9 technology.
The locomotor behavior of the generated letm1+/- mutants was further assessed, but did not show an abnormal movement behavior. Furthermore, the established fish lines will serve as important models to investigate additional aspects of Letm1 and Letm2. Moreover, to conduct localization studies two different sets of expression vectors, carrying the fluorescent tagged fish letm1 or letm2 were introduced in zebrafish embryos and HeLa cells. Confocal imaging revealed that both proteins were explicitly localized in the fish and human mitochondria.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Letm1 Letm2 Zebrafish Mitochondria KHE
Schlagwörter
(Deutsch)
Letm1 Letm2 Zebrafisch Mitochondrien KHE
Autor*innen
Stefan Hajny
Haupttitel (Englisch)
A zebrafish model of Letm1 and Letm2 deficiency
Paralleltitel (Deutsch)
Etablierung eines Zebrafisch-Modells zur Untersuchung einer Letm1 und Letm2 Defizienz
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
II, 93 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Karin Nowikovsky
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.48 Medizinische Genetik
AC Nummer
AC13016454
Utheses ID
36043
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |