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Evaluation of chemically modified splice-switching oligonucleotides in an in vitro luciferase assay

Pia Gabriela Vilim

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Johannes Winkler

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DOI

10.25365/thesis.40807

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29488.23411.622861-6

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung von chemisch modifizierten splice-switching Oligonukleotiden in einem in vitro Luciferase Assay. Wenn der äußerst komplexe Vorgang des Spleißens fehlerhaft durchgeführt wird, ist das oft der Auslöser für genetische Erkrankungen wie etwa die Duchenne Muskeldystrophie und die Mittelmeeranämie. Splice-switching Oligonukleotide können defekte Spleißvorgänge beeinflussen und bieten daher eine praktikable Therapiemöglichkeit. Um die Effizienz der Oligonukleotidtherapie zu steigern, muss allerdings die Aufnahme in die Zellen verbessert werden, bestenfalls ohne die Verwendung der toxischen, kationischen Transfektionsreagenzien. Die Oligonukleotide, die in dieser Arbeit verwendet wurden, sind chemisch modifiziert und tragen meist in 2’-Position einen Thiol- oder Aminohexyllinker. Die Linker wurden in weiterer Folge zur Konjugation mit PEG-Ketten oder Oligolysin-Peptiden verwendet, dadurch soll den Oligonukleotiden die Fähigkeit verliehen werden aus dem Endosom und in den Zellkern zu gelangen. Im ersten Schritt wurde der Reporterassay in Bezug auf Zellzahl, Inkubationszeit sowie Auswahl und Konzentration der Vergleichssubstanzen optimiert. Die Testung auf spleißmodulierende Aktivität und zeitgleich auf Zellaufnahme ohne Transfektionsreagenz wurde mittels HeLa-Zellen ermittelt, die stabil mit dem Plasmid 705 transfiziert waren. Dieses Zellkulturmodell exprimiert ein inaktives Luciferaseenzym, welches erst durch Spleiß-Modulation aktiviert wird. Die Testsubstanzen wurden jeweils in Triplets gemessen, gegen die unbehandelten Zellen standardisiert und über ein Bradford Assay normalisiert. Die Ergebnisse zeigten Hochregulation der Luciferase in Kombination mit Transfektionsreagenz bei acht von acht Peptid-konjugierten Substanzen und vier von sieben PEG-konjugierten. Die Zellaufnahme (ohne Transfektionsreagenz) war bei drei Substanzen erfolgreich, diese waren alle mit dem Oligolysin C5K konjugiert. Die Zytotoxizitätstests zeigten keinen toxischen Effekt der Pepid-gekoppelten Substanzen. Die Messung der Partikelgrößenverteilung zeigte eine Komplexbildung von Lipofectamin mit den Peptid-gekoppelten Testsubstanzen ähnlich der mit SSO. Die CD-Spektren zeigen die Ausbildung von Duplexen, wobei die Peptide die Sekundärstruktur mehr verändern als die PEG-Ketten. Zusammenfassend wurde die Zellaufnahme und die daraus folgende Hochregulation des Luciferasegens für die Substanzen bewiesen, die mit C5K konjugiert waren.

Abstract

(Englisch)

This thesis is an evaluation of chemically modified splice-switching oligonucleotides in an in vitro luciferase assay. If the highly complex process of splicing is defective, it is often the trigger of genetic diseases like the Duchenne muscular dystrophy (DMD) or β-Thalassaemia. Splice-switching oligonucleotides have the ability of altering defect splicing and are therefore a viable strategy in curing those diseases. To enhance the effectiveness of oligonucleotide therapy, it is necessary to improve cellular uptake of oligonucleotides without the use of cationic lipid preparations, which are often toxic. The oligonucleotides in this thesis were synthesized with chemically modified nucleotides which carry a linker, like thiol- or aminohexyllinker mostly in 2’-position. These linkers were then used for the conjugation with PEG8-chains or oligolysine-peptides to enable the oligonucleotides to escape endosomal trapping and cross into the nucleus. In the first step the dual-luciferase reporter assay was optimized for the use with oligonucleotides concerning cell-count, incubation time and concentration and selection of control substances. The evaluation of splice-switching activity and simultaneously the evaluation of cellular uptake were done using HeLa cells, stably transfected with the pLuc705 plasmid. This reporter assay cell culture model produced an inactive Luciferase enzyme, which could only be activated by splice-switching oligonucleotides. The substances were all measured in triplets, with and without the use of lipofectamine, data was then standardized over untreated cells and normalized using Bradford assay. The results showed up-regulation of luciferase in combination with lipofectamine in eight out of eight oligolysine conjugated oligonucleotides but only in four out of seven with PEG-conjugation. Cellular uptake (without the use of lipofectamine) was observed in three substances: All of them were conjugated with the oligolysine-peptide C5K. During the cell viability assay, no toxic effect induced by the peptide-conjugated substances was detected. The size distribution measurement using light scattering proved the formation of lipoplexes with peptide-coupled test substances and lipofectamine similar to those with the unmodified SSO. The measurement of the CD-spectra proved the formation of duplexes. The secondary structure is influenced more heavily by the peptides than by the PEG-chains. In total, cellular uptake and consequential up regulation of luciferase genes was proved for the substances conjugated with the oligolysine-peptide C5K.

Autor*innen

Pia Gabriela Vilim

Haupttitel (Englisch)

Evaluation of chemically modified splice-switching oligonucleotides in an in vitro luciferase assay

Paralleltitel (Deutsch)

Evaluierung von chemisch modifizierten spleißregulierenden Oligonukleotiden in einem invitro Luciferase Assay

Publikationsjahr

2016

Umfangsangabe

VI, 50 Seiten : Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Johannes Winkler

Klassifikation

35 Chemie > 35.65 Nukleinsäuren

AC Nummer

AC13032431

Utheses ID

36135

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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