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Cloning, expression and functional characterization of flagellin from Salmonella typhimurium
Stephan Deifl
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Thomas Decker
DOI
10.25365/thesis.4109
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30345.85895.647453-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Liganden für Toll-like Rezeptoren (TLR) werden als mögliche Adjuvantien in Impfstoffen für
die allergen-spezifische Immuntherapie diskutiert. So konnte beispielsweise gezeigt werden,
dass die Beimengung von DNA, die CpG-Motive enthält und von TLR9 erkannt wird, zu
Allergieimpfstoffen die allergische Immunantwort gegen-regulieren kann. In dieser
Diplomarbeit wurde untersucht, ob das bakterielle Protein Flagellin, welches von TLR5
erkannt wird, ebenfalls immunmodulierende Eigenschaften aufweist. In weiterer Folge sollte
Flagellin von Salmonella typhimurium als rekombinantes Protein hergestellt werden.
Zunächst wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) von Birkenpollenallergikern
mit Flagellin von S. typhimurium stimuliert. Die darauf folgende Zytokinantwort wurde
mittels ELISA analysiert. Es wurde die Produktion von IFN-γ sowie IL-10 festgestellt, was
darauf hindeutete, dass Flagellin als Adjuvans wirksam sein könnte. Als nächsten Schritt
etablierten wir ein Testmodell, um eine Aktivierung über TLR5 rasch nachzuweisen. Dieses
Modell basierte einerseits auf der Verwendung von humanen embryonalen Nierenzellen
(human embryonic kidney cells, HEK cells), die mit TLR5 stabil transfiziert worden waren
und andererseits auf der Stimulation von CaCo-2 Zellen. Parallel dazu wurde die Wichtigkeit
der Präsenz von hitzelabilen Serumfaktoren für die Aktivierung über TLR5 untersucht. Die
Resultate bei Verwendung von kommerziell erhältlichem Flagellin von S. typhimurium
zeigten, dass HEK-293/TLR5 Zellen bei Beimengung von fötalem Kälberserum (10%) zum
Nährmedium bestens geeignet waren, die Aktivierung über TLR5 nachzuweisen.
Wir versuchten, Flagellin von S. typhimurium in einen geeigneten Vektor zu klonieren und
das Protein in E. coli BL21(DE3)pLysS Zellen zu exprimieren. Da mehrere Versuche, das
Gesamtprotein rekombinant herzustellen, scheiterten, haben wir uns auf die Herstellung der
C- und N-terminalen Fragmente des Proteins konzentriert. Diese konservierten Bereiche sind
wesentlich an der Bildung der D0 und D1 Domänen von Flagellin beteiligt, die von TLR5
gebunden werden. Wir konnten sowohl das C- als auch das N-terminale Protein in E. coli
BL21(DE3)pLysS Zellen exprimieren und mittels chromatographischer Methoden reinigen,
jedoch konnten weder die einzelnen Fragmente, noch eine Mischung beider Proteine, TLR5
aktivieren. Daraufhin wurde ein Fusionsprotein, in dem die C- und N-terminalen Fragmente
von Flagellin aus S. typhimurium mit einer Gelenksregion aus einem E. coli Protein verknüpft
wurden, hergestellt. Dieses Fusionsprotein konnte exprimiert und gereinigt werden und erste
Tests auf HEK-293/TLR5 Zellen führten zu IL-8 Produktion. Dies zeigte, dass die C- und Nterminalen
Fragmente verknüpft und in räumliche Nähe gebracht werden müssen, um TLR5
zu aktivieren.
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Zusammenfassend weisen mehrere Ergebnisse, aus Versuchen mit Zellen von Allergikern,
darauf hin, dass Flagellin immunmodulatorische Eigenschaften aufweist. Es wurde ein
Testmodell für den Nachweis einer Aktivierung von TLR5 etabliert und ein rekombinantes
Fusionsprotein hergestellt, das aus den hochkonservierten N- und C-terminalen Fragmenten
von Flagellin aus S. typhimurium sowie einer Gelenksregion aus E. coli besteht. Dieses
Fusionsprotein konnte TLR5 aktivieren.
In nächster Zukunft ist geplant, dieses Fusionsprotein in ausreichender Menge endotoxinfrei
herzustellen und hinsichtlich seiner immunmodulatorischen Effekte auf PBMC von
Allergikern zu testen.
Abstract
(Englisch)
Toll-like receptor (TLR) ligands may be employed as adjuvants for allergen-specific
immunotherapy. For example, CpG motifs recognized by TLR9 were shown to promote the
counter regulation of the allergic immune response when added to allergy vaccines. We were
interested to investigate whether the bacterial protein flagellin, a TLR5 ligand, excerted
immunomodulating effects on cells of allergic patients and to produce flagellin in
recombinant form.
As a first step, we stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from birch pollenallergic
patients with commercially available flagellin from Salmonella typhimurium and
analysed cytokine expression by ELISA. The induction of IFN-γ and IL-10 indicated that
flagellin had potential adjuvant activity. Next, we established a read out system to detect
TLR5-triggering using human embryonic kidney (HEK) cells stably transfected with TLR5 as
well as CaCo-2 cells. In parallel, we assessed the influence of heat-labile serological factors
on the ability of flagellin to activate TLR5. Our results indicated that HEK-293/TLR5 cells in
the presence of FCS (10%) were best suited for testing TLR5 triggering by flagellin.
Next we tried to clone flagellin from S. typhimurium in a suitable vector and express the
protein in E. coli BL21(DE3)pLysS cells. As different attempts to produce recombinant
flagellin failed, we focussed on the expression of the C- and N-terminal fragments of the
protein. These conserved regions form the D0 and D1 domain of flagellin responsible for
recognition by TLR5. Both protein fragments were successfully expressed in E. coli
BL21(DE3)pLysS cells and purified by chromatography. However, neither a mixture nor the
C- and N-terminal fragments alone bound to TLR5. Therefore, we designed a fusion protein
linking both fragments with a hinge region from E. coli. This fusion protein was expressed,
purified by chromatography and tested on HEK-293/TLR5 cells. Stimulation of the cell line
with the fusion protein led to IL-8 synthesis revealing that the N- and C-terminal fragments
need to be brought into close proximity to bind and activate TLR5.
In summary, we showed that flagellin may have immunomodulatory effects on cells of
allergic patients. Moreover, we established a test system for TLR5 triggering and produced a
recombinant fusion protein consisting of the highly conserved N- and C-terminal fragments of
flagellin from S. typhimurium linked by a hinge region from E. coli with the capacity to
trigger TLR5.
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In the future, it is planned to produce sufficient amounts of the recombinant fusion protein in
high purity and free of endotoxins to evaluate its immunomodulatory effects on PBMC of
allergic donors.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
flagellin Salmonella typhimurium TLR5
Schlagwörter
(Deutsch)
Flagellin Salmonella typhimurium TLR5
Autor*innen
Stephan Deifl
Haupttitel (Englisch)
Cloning, expression and functional characterization of flagellin from Salmonella typhimurium
Paralleltitel (Deutsch)
Klonierung, Expression und funktionelle Charakterisierung von Flagellin von Salmonella typhimurium
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
97 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Thomas Decker
AC Nummer
AC08068572
Utheses ID
3631
Studienkennzahl
UA | 441 | | |