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Cultivation and characterisation of porcine endothelial cells for toxicity analysis by flow cytometry
Julia Golus
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Manfred Ogris
DOI
10.25365/thesis.41129
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30411.37457.707770-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Lineares Polyethylenimin (LPEI) ist eine “Goldstandard”-Referenz der Gentransfektion für eine große Breite an verschiedenen Zelllinien- und typen (Tumorzellen eingeschlossen). Es wird bereits in humanen, klinischen Versuchen zur Gentherapie von Krebspatienten angewendet. Das Polykation weist neben einer hohen Transfektionseffizienz jedoch auch eine hohe Zelltoxizität auf. In diesem Zusammenhang optimierte ich die in vitro Kultivierung und Charakterisierung von primären Schweine-Endothelzellen um Zelltoxizitätstest zu ermöglichen. Die Endothelzellen wurden hierbei aus der Schweineaorta entnommen, in Zellkulturschalen ausgelegt und mit speziellem Kulturmedium gezüchtet. Jedoch musste festgestellt werden, dass die isolierten Primärzellen, nach 5-6 Passagen mit Fibroblasten-ähnlichen Zellen kontaminiert waren. Daher wurden langfristige Erhaltungssysteme für primäre Endothelzellen entwickelt. Der Einfluss niedriger Konzentrationen von FCS im Medium auf die Zellviabilität und Proliferationsrate wurde untersucht. Weiters ermöglichte eine Gelatinebeschichtung stabile Kulturbedingungen. Auch die Notwendigkeit frühzeitiger Subkultivierung noch vor einer kompletten Konfluenz wurde ermittelt. Hierbei wurden die Endothelzellen durch mikroskopische Analyse ihrer Morphologie und Expression endothel-spezifischer Marker mittels Durchflusszytometer charakterisiert. Eine Langzeitkultivierung bis Passage 22 wurde durchgeführt mit über 90% CD31 Positivität und typischer Pflasterform bis Passage 19. Folglich wurde ein LPEI-Zytotoxizitätstest mit unterschiedlichen Molekulargewichten und unterschiedlichen Konzentrationen realisiert. Die erhaltenen Resultate liefern einen Einblick in den toxischen Effekt von LPEI verglichen mit dem Alkaloid Camptothecin. Diese Arbeit schafft Grundlagen für die Langzeitkultivierung von hochreinen primären Schweine-Endothelzellen.
Abstract
(Englisch)
Linear polyethylenimine (LPEI) is a golden standard reference in gene transfection for a broad range of cell lines- and types, including tumour cells, and is already used in human clinical trials for gene therapy approaches in cancer patients. Despite its high transfection efficiency, cytotoxicity seems to be a limiting factor. Here I optimized the in vitro cultivation and characterization of primary porcine endothelial cells (pEC) in order to facilitate cytotoxicity studies. At first endothelial cells where isolated from porcine thoracic aorta, seeded on culture dishes, and maintained with specialized culture medium. However, after five to six passages, primary isolated cells were contaminated with fibroblast-like cells. Therefore, a long-term maintenance system of pEC was established. The effect of lower concentrations of FCS in medium on cell viability and proliferation rate was investigated. Further, gelatine-coating ensured stable culture conditions and the importance of early splitting before complete confluency was determined. Thereby pECs were characterized by analysing morphology under a microscope and expression of endothelial specific marker CD31 by fluorescent-activating cell sorting (FACS) determined. A long-maintenance up to passage 22 was performed with over 90% of CD31 positivity and typical cobble-stone shape until passage 19. Consequently, a cytotoxicity assay with LPEI with different molecular weights and increasing concentrations was realised. Obtained results provide insights into the toxic effect of LPEI compared to the alkaloid camptothecin. With this study the foundations have been laid for long-term maintenance of highly pure primary porcine endothelial cells.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
porcine endothelial cells toxicity LPEI
Schlagwörter
(Deutsch)
Schweine-Endothelzellen Toxizität LPEI
Autor*innen
Julia Golus
Haupttitel (Englisch)
Cultivation and characterisation of porcine endothelial cells for toxicity analysis by flow cytometry
Paralleltitel (Deutsch)
Kultivierung und Charakterisierung von Schweine-Endothelzellen zur Toxizitätsanalyse mittels Durchflusszytometrie
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
43 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Manfred Ogris
AC Nummer
AC13061813
Utheses ID
36401
Studienkennzahl
UA | 449 | | |