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Phage P100 in food industry
critical view on the current state of affairs and innovative solutions based on ionic liquids
Susanne Fister
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Biologie)
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.41518
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29396.69439.873264-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Weltweit ist Lebensmittelsicherheit ein wichtiges Thema und ungefährliche Nahrung ist ein grundlegendes Menschenrecht. Zur Bereitstellung mikrobiologisch unbedenklicher Lebensmittel ist ein umfassendes Konzept nötig, das sowohl die Detektion als auch die Entfernung von Lebensmittelpathogenen beinhaltet und als „diagnostische Kette“ zusammengefasst werden kann.
Innerhalb der diagnostischen Kette war der Phage P100 das zentrale Thema dieser Dissertation. Es wurde untersucht, ob Resistenzen gegen den Phagen bereits vorkommen oder sich entwickeln und wie sich Umweltfaktoren auf die Stabilität des Phagen und auf die Wirt-Phagen Interaktion auswirken. Die Ergebnisse zeigen, dass der Phage P100 unter den meisten getesteten Umweltbedingungen sehr stabil ist und an seinen Wirt binden kann. Im Gegensatz dazu war die Replikation des Phagen vom Wachstum von L. monocytogenes abhängig. Der Einsatz von Phagen war erfolgreicher bei Umweltbedingungen, die das Wachstum von L. monocytogenes einschränkten. Es wurde gezeigt, dass sich Resistenzen gegen den Phagen P100 entwickeln und dieses Phänomen mit dem Einsatz und der Verbreitung von kommerziell erhältlichen Phagenprodukten zusammenhängt. Diese Resistenzen entstehen wahrscheinlich durch eine Reaktion der Bakterien auf die Phagen.
Phagen im Betriebsumfeld oder den Proben stören die mikrobiologische Detektion des Wirtsbakteriums, da diese auf der Anreichung von Bakterien basiert. Deshalb wurde untersucht, ob sich ionische Flüssigkeiten zur Inaktivierung der Phagen eignen und wie sie auf Viren oder Phagen wirken. Erstmals wurden ionische Flüssigkeiten gefunden, die Phagen (P100 und MS2) inaktivieren. Auch der viel beschriebene Seitenketten-Effekt, die häufigste Struktur-Aktivitätsbeziehung ionischer Flüssigkeiten, konnte bei den getesteten Viren festgestellt werden. Außerdem wurde eine qPCR entwickelt, um P100 in Routineuntersuchungen zu detektieren. Diese qPCR konnte P100 in natürlich kontaminieren Schmierwasserproben detektieren. Allerdings muss die Spezifität dieser PCR noch weiter untersucht werden. Da die quantitative Isolation von Nucleinsäuren Voraussetzung für eine zuverlässige PCR ist, wurde eine Methode basierend auf ionischen Flüssigkeiten entwickelt, um Virenpartikel aufzubrechen und danach Nucleinsäuren zu isolieren. Mit verschiedenen ionischen Flüssigkeiten konnten höhere Ausbeuten an viraler RNA und viraler DNA als mit dem kommerziellen Kit erzielt werden. Weil manche dieser ionischen Flüssigkeiten Nucleasen inhibierten, könnten sie in Zukunft auch zur Lagerung von Nukleinsäuren oder als RNase oder DNase Inhibitoren verwendet werden. Innerhalb der analytischen Kette ist ebenfalls eine adäquate Probenaufarbeitungsmethode ausschlaggebend. Deshalb wurde die alternative Methode Matrixlysis ausgetestet. Die verwendeten Puffer verminderten die Infektiösität und Nachweisbarkeit der getesteten Viren (MS2 und FCV) nicht entscheidend und eignen sich deshalb für die mikrobiologische und molekularbiologische Virendetektion.
Abstract
(Englisch)
Food safety is globally a public health priority and the availability of safe food is a basic human right. To guarantee microbiologically safe food a systems approach, summarised as diagnostic chain, is necessary, including detection and removal or inactivation of food-borne pathogens.
In this thesis the focus within the diagnostic chain was Listeria phage P100. The presence and development of resistance to P100 was investigated as well as the influence of environmental factors on the stability of the phage per se and on the host-phage interaction. Results indicate that phage P100 is stable and binds to the host under most conditions tested. Replication was dependent upon the growth of L. monocytogenes and efficacy of phage treatments was higher when bacterial growth was simultaneously reduced by appropriate environmental conditions. Experiments revealed a first evidence for resistance development to P100 in L. monocytogenes and its linkage to the artificial spread of commercially available phages. Furthermore, this resistance development seems to be actively promoted by the bacterial cell in response to contact with P100.
Since the presence of phages in the production plant interferes with host bacteria detection using enrichment based diagnostics, P100 inactivation by ionic liquids and their effects on viruses was examined. For the first time ionic liquids were identified inactivating phages P100 and MS2. In addition, the most commonly recognized structure activity relationship characteristic of ionic liquids, the so called side chain effect, was also applicable to viruses. A qPCR assay for detection of P100 to monitor routine diagnostics was developed and has already been tested in naturally contaminated smear water samples. However, further specificity testing is necessary. As reliable qPCR detection requires quantitative isolation of nucleic acids, the use of ionic liquids for virus disintegration and subsequent isolation of nucleic acids was investigated. Ionic liquids transpired to be promising tools for both the isolation of viral RNA and DNA, and recovery rates higher than those achieved with commercially available kits were obtained. As some of the ionic liquids tested had inhibitory effects on nucleases, these compounds may prove useful for storage of nucleic acids or as RNAse or DNase inhibitors. Finally, adequate sample preparation is crucial to the analytical chain. Therefore, the alternative sample preparation method Matrixlysis was investigated. Depending on the buffer system used, Matrixlysis did not distinctly reduce infectivity or detectability of FCV and MS2 and may find application for subsequent virus detection with both microbiological and molecular biological detection methods.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
phage P100 Listeria monocytogenes resistance food safety
Schlagwörter
(Deutsch)
Phage P100 Listeria monocytogenes Resistenz Lebensmittelsicherheit
Autor*innen
Susanne Fister
Haupttitel (Englisch)
Phage P100 in food industry
Hauptuntertitel (Englisch)
critical view on the current state of affairs and innovative solutions based on ionic liquids
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
X, 101 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Thomas Alter ,
Siegfried Scherrer
AC Nummer
AC13081336
Utheses ID
36748
Studienkennzahl
UA | 094 | 437 | |