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Identifizierung von Substratproteinen von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen durch Massenspektrometrie
Alessandro Carreri
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Heribert Hirt
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29835.98170.874269-3
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs) sind in eukaryotischen Organismen
vorkommende Proteine, die der Weiterleitung exogener Signale an entsprechende
Effektoren dienen. Die von pflanzlichen Genomen kodierten MAPK-Familien sind
besonders umfangreich; in Arabidopsis thaliana, beispielsweise, existieren 20
MAPK-Gene. Bis auf wenige Ausnahmen sind die von pflanzlichen MAPKs
regulierten Zielproteine unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle
MAPK-Substratproteine analysiert. Diese waren in einer vorangegangenen Studie
anhand des Auftretens von Phosphopeptiden, deren Sequenz dem von MAPKs
erkannten Konsensusmotif entspricht, ausgewählt worden. Für acht potentielle
Substratproteine wurden rekombinante Proteine aufgereinigt und auf
Phosphorylierbarkeit durch die MAPKs MPK3, MPK4 und MPK6 in in vitro-Kinase-
Experimenten getestet. Dabei zeigten die drei MAPKs deutliche Unterschiede
hinsichtlich ihrer Spezifität für diese acht Substrate. Bei fünf der Kandidaten konnten
die phosphorylierten Gruppen durch Flüssigchromatographie-Tandem-
Massenspektrometrie (LC-MS/MS/MS) den entsprechenden Aminosäureresten
zugeordnet werden. Dies sind die Proteine: Phosphoglucose-Isomerase 1 (PGI1), das
putative Golgi SNARE protein GOS12, der mechanosensitive Ionenkanal MSL9, eine
Histon-Deacetylase (HDT2/HD2b) sowie Phosphatidylinositol-4-phosphat-Kinase
4ß1 (PI-4Kß1). Die LC-MS/MS/MS-Analysie zeigte außerdem, dass jedes der
untersuchten MAPK-Substratproteine mehrere phosphorylierte Reste enthielt. In in
vitro Kinase-Experimenten wurde für fast alle der in vivo-identifizierten
Phosphopeptide eine Modifizierung durch MAPKs beobachtet. Dies deutet darauf hin,
dass die untersuchten Proteine potentielle in vivo-Substrate für MAPKs darstellen.
Mit Hilfe von fluoreszierenden Fusionsproteinen an HDT2 und seiner an der
phosphorylierbaren Aminosäure mutierten Derivate konnte gezeigt werden, dass
Verlust der Phosphorylierung zur partiellen Exclusion des Proteins vom Nukleolus
führt. Weiters wurde für GOS12 eine phosphorylierungsabhängige Lokalisation im
Golgi-Apparat beobachtet und eine potentielle Rolle von GOS12 im Erhalt der Golgi-
Struktur abgeleitet. Die Behandlung von Protoplasten mit dem bakteriellen Elicitor
flg22 führte zur Relokalisierung von GOS12 aus Nukleus und Cytoplasma zum
Golgi-Apparat. Zusammengefasst, konnten durch die auf MS-Daten basierende
Herangehensweise MAPK Substrate ihren spezifischen MAPKs zugeordnet werden.
Eine potentielle Rolle von MAPKs in der Regulation des Vesikeltransports und der
Histon-Deacetylierung in Pflanzen wurde aufgedeckt
Abstract
(Englisch)
Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) transmit numerous incoming signals to
downstream targets in animals and yeasts. Plant genomes encode the largest families
of MAPKs in all eukaryotes, with 20 members in Arabidopsis thaliana. With a few
exceptions, however, downstream targets have remained undiscovered. Here, we
present a systematic screen for Arabidopsis MAPK substrates. Potential MAPK
targets were selected on the basis of previously identified in vivo phosphorylation
sites that match a MAPK motif. Eight candidates were purified and tested in in vitro
kinase assays for phosphorylation by MPK3, -4, -6. These MAPKs clearly differed in
their specificity towards these substrates. Phosphorylation sites were mapped by
liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS/MS) in
phosphoglucose isomerase 1 (PGI1), the putative Golgi SNARE protein GOS12, the
mechanosensitive ion channel MSL9, the histone deacetylase HDT2/HD2B and
phosphatidylinositol 4-phosphate kinase 4ß1 (PI-4Kß1). This analysis showed that
MAPKs phosphorylate multiple residues in each substrate. Moreover, nearly all in
vivo sites were phosphorylated in vitro by MAPKs, suggesting that these candidates
could be in vivo targets. The phosphosite mapping and subsequent mutagenesis
showed that several candidates were phosphorylated on multiple residues. The use of
a fluorescent protein reporter showed that a phosphorylation site mutant of HDT2
excludes a subpool of the protein from the nucleolus. Moreover, the use of
phosphosite mutants of GOS12 showed that phosphorylation of GOS12 likely
mediates Golgi localization and that GOS12 is involved in maintaining Golgi
morphology. Treatment of protoplasts with flg22 caused relocalization of GOS12
from the nucleus and cytosol to the Golgi, similar to the phosphomimicking mutant.
This selective MS-based approach to connect MAPK isoforms with these MAPK
substrates revealed a potential MAPK network regulating vesicular trafficking and
histone deacetilation in plants.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
MAPK kinase substrate mass spectrometry phosphosite mapping signalling network
Schlagwörter
(Deutsch)
MAPK Kinasesubstrat Massenspektrometrie Charakterisierung von Phosphorylierungsstellen Signalnetzwerk
Autor*innen
Alessandro Carreri
Haupttitel (Englisch)
Identifizierung von Substratproteinen von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen durch Massenspektrometrie
Paralleltitel (Englisch)
Mass spectrometry-based screening for mitogen-activated protein kinase substrates
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
103 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Thorsten Nürnberger ,
Marie-Theres Hauser
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC05039937
Utheses ID
3697
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |