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Identifizierung von Substratproteinen von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen durch Massenspektrometrie

Alessandro Carreri

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Heribert Hirt

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29835.98170.874269-3

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs) sind in eukaryotischen Organismen vorkommende Proteine, die der Weiterleitung exogener Signale an entsprechende Effektoren dienen. Die von pflanzlichen Genomen kodierten MAPK-Familien sind besonders umfangreich; in Arabidopsis thaliana, beispielsweise, existieren 20 MAPK-Gene. Bis auf wenige Ausnahmen sind die von pflanzlichen MAPKs regulierten Zielproteine unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle MAPK-Substratproteine analysiert. Diese waren in einer vorangegangenen Studie anhand des Auftretens von Phosphopeptiden, deren Sequenz dem von MAPKs erkannten Konsensusmotif entspricht, ausgewählt worden. Für acht potentielle Substratproteine wurden rekombinante Proteine aufgereinigt und auf Phosphorylierbarkeit durch die MAPKs MPK3, MPK4 und MPK6 in in vitro-Kinase- Experimenten getestet. Dabei zeigten die drei MAPKs deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Spezifität für diese acht Substrate. Bei fünf der Kandidaten konnten die phosphorylierten Gruppen durch Flüssigchromatographie-Tandem- Massenspektrometrie (LC-MS/MS/MS) den entsprechenden Aminosäureresten zugeordnet werden. Dies sind die Proteine: Phosphoglucose-Isomerase 1 (PGI1), das putative Golgi SNARE protein GOS12, der mechanosensitive Ionenkanal MSL9, eine Histon-Deacetylase (HDT2/HD2b) sowie Phosphatidylinositol-4-phosphat-Kinase 4ß1 (PI-4Kß1). Die LC-MS/MS/MS-Analysie zeigte außerdem, dass jedes der untersuchten MAPK-Substratproteine mehrere phosphorylierte Reste enthielt. In in vitro Kinase-Experimenten wurde für fast alle der in vivo-identifizierten Phosphopeptide eine Modifizierung durch MAPKs beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die untersuchten Proteine potentielle in vivo-Substrate für MAPKs darstellen. Mit Hilfe von fluoreszierenden Fusionsproteinen an HDT2 und seiner an der phosphorylierbaren Aminosäure mutierten Derivate konnte gezeigt werden, dass Verlust der Phosphorylierung zur partiellen Exclusion des Proteins vom Nukleolus führt. Weiters wurde für GOS12 eine phosphorylierungsabhängige Lokalisation im Golgi-Apparat beobachtet und eine potentielle Rolle von GOS12 im Erhalt der Golgi- Struktur abgeleitet. Die Behandlung von Protoplasten mit dem bakteriellen Elicitor flg22 führte zur Relokalisierung von GOS12 aus Nukleus und Cytoplasma zum Golgi-Apparat. Zusammengefasst, konnten durch die auf MS-Daten basierende Herangehensweise MAPK Substrate ihren spezifischen MAPKs zugeordnet werden. Eine potentielle Rolle von MAPKs in der Regulation des Vesikeltransports und der Histon-Deacetylierung in Pflanzen wurde aufgedeckt

Abstract

(Englisch)

Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) transmit numerous incoming signals to downstream targets in animals and yeasts. Plant genomes encode the largest families of MAPKs in all eukaryotes, with 20 members in Arabidopsis thaliana. With a few exceptions, however, downstream targets have remained undiscovered. Here, we present a systematic screen for Arabidopsis MAPK substrates. Potential MAPK targets were selected on the basis of previously identified in vivo phosphorylation sites that match a MAPK motif. Eight candidates were purified and tested in in vitro kinase assays for phosphorylation by MPK3, -4, -6. These MAPKs clearly differed in their specificity towards these substrates. Phosphorylation sites were mapped by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS/MS) in phosphoglucose isomerase 1 (PGI1), the putative Golgi SNARE protein GOS12, the mechanosensitive ion channel MSL9, the histone deacetylase HDT2/HD2B and phosphatidylinositol 4-phosphate kinase 4ß1 (PI-4Kß1). This analysis showed that MAPKs phosphorylate multiple residues in each substrate. Moreover, nearly all in vivo sites were phosphorylated in vitro by MAPKs, suggesting that these candidates could be in vivo targets. The phosphosite mapping and subsequent mutagenesis showed that several candidates were phosphorylated on multiple residues. The use of a fluorescent protein reporter showed that a phosphorylation site mutant of HDT2 excludes a subpool of the protein from the nucleolus. Moreover, the use of phosphosite mutants of GOS12 showed that phosphorylation of GOS12 likely mediates Golgi localization and that GOS12 is involved in maintaining Golgi morphology. Treatment of protoplasts with flg22 caused relocalization of GOS12 from the nucleus and cytosol to the Golgi, similar to the phosphomimicking mutant. This selective MS-based approach to connect MAPK isoforms with these MAPK substrates revealed a potential MAPK network regulating vesicular trafficking and histone deacetilation in plants.

Autor*innen

Alessandro Carreri

Haupttitel (Englisch)

Identifizierung von Substratproteinen von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen durch Massenspektrometrie

Paralleltitel (Englisch)

Mass spectrometry-based screening for mitogen-activated protein kinase substrates

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

103 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Thorsten Nürnberger ,

Marie-Theres Hauser

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC05039937

Utheses ID

3697

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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Schlagwörter