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Semisynthesis and characterization of homogenously modified prion protein variants
Mehmet Can Araman
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (Dissertationsgebiet: Chemie)
Betreuer*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29157.58614.251353-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSEs) sind neurodegenerative Krankheiten, die nicht heilbar sind und tödlich verlaufen. Diesen Erkrankungen liegen die fehlgefalteten Aggregate des Prion Proteins (PrP) zu Grunde. Es ist noch nicht komplett verstanden, wie diese Aggregate gebildet werden und wann bzw. warum die konformationelle Umwandlung von zellulärem PrP ins pathogene scrapie PrP geschieht. Es gibt überzeugende Beweise, dass PrP an der Außenseite der Zellmembran durch einen GPI verankert wird und die Konformationsveränderung von PrP dort passiert. PrP ist ein N-glykosyliertes Protein, wobei unterschiedliche Prionen-Stämme verschiedene N-Glykan-Muster aufweisen. Der Glykosylierungsstatus von scrapie PrP spielt eine entscheidende Rolle bei manchen TSEs. Diese Befunde verdeutlichen, dass posttranslationale Modifikationen (PTMs) bei der Einleitung von Konformationsänderung des Prion Proteins eine beträchtliche Rolle spielen können. Folglich werden möglichst homogene, posttranslational modifizierte PrP-Varianten in genügender Quantität gebraucht, um diese als Werkezeuge zu nutzen, den Einfluss von PTMs auf die Pathogenese der Prionen-Erkrankungen zu untersuchen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine neue Strategie entwickelt, welche den Zugang zu homogenen, posttranslational modifizierten PrP-Varianten ermöglicht. Dabei stand besonders die Semisynthese von ortsspezifisch- (an Positionen 181 und 197) PEGylierten PrP-Varianten im Mittelpunkt. Zwei rekombinante PrP α-thioester, welche die Aminosäuren 23 bzw. 90-177 umfassen, wurden in guten Ausbeuten erhalten. Ferner wurden ortsspezifisch PEGylierte PrP Peptide und PrP-Thioester Vorläufer (SEA Peptide) mittels Fmoc Festphasenpeptidsynthese in guten Ausbeuten und Reinheit erhalten. Diese Komponenten wurden mittels der selektiven Expressed Protein Ligation (EPL) verknüpft, um homogene, mono- und di-PEGylierte PrP-Varianten zu erhalten. Alle Ligationsprodukte wurden in ausreichender Menge und hoher Reinheit erhalten. Die neuen PrP-Varianten wurden biophysikalisch und biochemisch charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die modifizierten PrP-Varianten einen geringeren α-helikalen Anteil als das nicht-modifiziertes PrP besitzen. Des Weiteren weisen die PEGylierten PrP-Varianten, unter Bedingungen, bei denen nicht-modifizierte PrP-Varianten aggregierten, keine Tendenz zur Aggregation auf. Folglich ist es gelungen, die ersten homogenen, ortsspezifisch-PEGylierten PrP-Varianten semisynthetisch herzustellen und eine erste biochemische Charakterisierung vorzunehmen.
Abstract
(Englisch)
Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are incurable, fatal and neurodegenerative diseases caused by misfolded prion protein (PrP) aggregates. It is still not entirely understood, how these aggregates are formed and when or why the conversion of cellular PrP into pathogenic scrapie PrP occurs. There has been convincing proof that PrP is anchored to the outer leaflet of the plasma membrane via a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor and that the conversion into scrapie PrP occurs there. PrP is N-glycosylated and different prion strains have distinct glycosylation patterns. Moreover, the rate of glycosylation of scrapie PrP has a major impact on certain prion diseases. These advances made it clear that posttranslational modifications (PTMs) on PrP may favor the conversion of PrP to scrapie PrP. Therefore, homogenous posttranslationally modified PrP variants are needed as tools to investigate the impact of PTMs on the pathogenesis of prion diseases. In this thesis, we described a new semisynthetic route that enables access to site specifically and homogenously PEGylated PrP variants at positions 181 and 197. Two recombinant PrP α-thioesters comprising amino acids 23/90-177 were obtained in very good yields. Furthermore, we utilized Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis and obtained PrP peptides and latent peptide α-thioesters (SEA peptides) in good yields and purity. These components were linked to each other via expressed protein ligation (EPL) reactions to give rise to homogenously mono- or di-PEGylated PrP variants. All ligation products were obtained in sufficient amounts and high purity. The new PrP variants were characterized using biophysical and biochemical methods. Interestingly, homogenous and site-specifically PEGylated PrP variants had lower α-helical content than semisynthetic non-PEGylated PrP. Furthermore, these protein variants showed no tendency for aggregation under conditions at which unmodified PrP variants aggregated. Thus, we generated the first homogenous and site-specifically PEGylated PrP variants and were able to perform preliminary biochemical characterization assays.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Prion Protein Biokonjugation Proteinchemie
Autor*innen
Mehmet Can Araman
Haupttitel (Englisch)
Semisynthesis and characterization of homogenously modified prion protein variants
Paralleltitel (Deutsch)
Semisynthese und Charakterisierung von homogen modifizierten Prion Protein-Varianten
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
168 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Walther Schmid ,
Henning D. Mootz
Klassifikation
35 Chemie > 35.62 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße
AC Nummer
AC13102679
Utheses ID
37114
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |