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Regulation of calcium channel expression in melanoma cells with wildtype and mutant BRAF

Matthias Wolf

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Genetik und Entwicklungsbiologie

Betreuer*in

Michael Grusch

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DOI

10.25365/thesis.42236

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-24223.51262.152262-6

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Eine V600E-Mutation im BRAF- Onkogen tritt in 8% aller Krebserkrankungen und 66% aller Melanomen auf und fördert in Melanomen die Proliferation und das Überleben von Tumorzellen. Der Einsatz von Vemurafenib, einem spezifischen Inhibitor von mutiertem BRAF, zeigt therapeutische Erfolge in der Behandlung des metastasierten Melanoms mit dieser Mutation. Auf Grund von Resistenzentwicklung, sind jedoch zusätzliche Therapieansätze erforderlich. Gestörte Calcium-Homöostase und die erhöhte Migrationsfähigkeit von Melanomzellen sind unter anderem auf eine Fehlregulierung der Plasmamembran Calcium-ATPase PMCA4b zurückzuführen. Inhibierung von mutiertem BRAF in Melanomzellen führt zu einem PMCA4b-Anstieg und in der Folge zu einem erhöhten Calcium-Ausstrom. Weiters zeigte sich, dass sowohl eine Behandlung mit Vemurafenib als auch eine künstliche Überexpression von PMCA4b zu einer deutlichen Verminderung der Migration von Melanomzellen führte. Neben onkogenem BRAF wurde auch eine epigenetische Regulation der PMCA4b-Expression durch Histon-Deacetylasen (HDAC) beschrieben. Ziel: Ein PMCA4b-Anstieg durch Inhibierung des mutierten BRAF zeigt einen Zusammenhang zwischen onkogenem BRAF und der Calcium-Homöostase in Melanomen. Diese Masterarbeit untersucht den Einfluss von okogenem BRAF und von HDAC-Inhibierung auf die mRNA-Expression von Calcium-Kanälen und von Transkriptionsfaktoren, die im Zusammenhang mit Calcium-Signalwegen in Melanomzellen stehen. Methoden: Melanomzellen mit unterschiedlichem BRAF-Status wurden mit Vemurafenib und mit dem HDAC-Inhibitor Valproinsäure behandelt. Expressionsänderungen wurden mittels quantitativer PCR (qPCR) gemessen. Zur Untersuchung der Hypothese, dass das Vorhandensein von mutiertem BRAF die PMCA4b-Transkription unterdrückt, wurden BRAF-exprimierende Retroviren hergestellt und Krebszellen mit diesen Retroviren (Wildtype oder BRAFV600E) transduziert. BRAF-Expression wurde mit Western Blot und qPCR überprüft. Durch SA-ß-gal-Färbung wurde Seneszenz von Melanomzellen auf Grund einer Überexpression von onkogenem BRAF untersucht. Ergebnisse: Vemurafenib erhöhte die PMCA4b-Expression in Melanomzellen mit mutiertem BRAF unterschiedlich stark je nach Zelllinie. Valproinsäure alleine oder kombiniert mit Vemurafenib förderte nicht nur eine PMCA4b-Expression sondern auch die Transkription von IP3R und CRAC-Kanälen in Melanomzellen mit onkogenem BRAF. Dies deutet auf einen erhöhten Calcium-Transport aus dem ER und einen gestärkten Calcium-Ausstrom aus den Zellen hin. Eine reprimierte Fra1-Expression in Vemurafenib-behandelten Melanomzellen mit mutiertem BRAF könnte auf eine mögliche PMCA4b-Regulierung durch AP1 hinweisen. Weiters förderten Vemurafenib und Valproinsäure die Expression von MITF. Ein Expressionanstieg von MITF, einem zentralen Transkriptionsfaktor in der Melanozyten-Differenzierung, deutet auf eine Reaktivierung von Zell-Differenzierungsprogramen hin. Fazit: Die Daten dieser Masterarbeit zeigen, dass Vemurafenib, Valproinsäure und eine Kombination aus beiden Inhibitoren die Expression von Calcium-Kanälen und der Transkriptionsfaktoren Fra1 und MITF beeinflussen. Die Wiederherstellung der Calcium-Homöostase durch HDAC Inhibitoren und Inhibitoren von onkogenem BRAF könnte zur reduzierten Metastasierung von Melanomen beitragen.

Abstract

(Englisch)

Background: The BRAF mutation V600E occurs in about 8% of human tumors and 66% of melanomas and has an oncogenic influence on cell survival and proliferation in melanomas. Treatment with the mutant BRAF-specific inhibitor vemurafenib has therapeutic value in metastatic melanoma with mutant BRAF. Nevertheless, drug resistance and limited therapy response require discovery of additional molecular targets. Decreased calcium efflux upon repression of the plasma membrane calcium ATPase PMCA4b results in altered calcium homeostasis and promotes migratory ability and metastatic activity in melanoma. Inhibition of mutant BRAF with vemurafenib in melanoma cells was recently found to increase protein levels of PMCA4b and enhance intracellular calcium clearance. Moreover, vemurafenib-treatment or ectopic expression of PMCA4b in melanoma cells with mutant BRAF decreased their migratory and lung colonizing ability. Besides oncogenic BRAF, epigenetic regulation of PMCA4b expression by histone deacetylases (HDAC) was described. Aim: Enhanced PMCA4b protein levels upon mutant BRAF inhibition in melanoma cells suggest a link between oncogenic BRAF and calcium homeostasis in melanoma. The aim of this thesis was to investigate in more detail the role of mutant BRAF and of HDAC inhibition in the regulation of intracellular calcium channels and of transcription factors involved in remodeling of intracellular calcium signaling in melanoma. Methods: Melanoma cell lines with different BRAF status were treated with vemurafenib and in addition with the HDAC inhibitor valproic acid to investigate their impact on calcium channels and melanoma-associated transcription factors. Transcript expression changes were analyzed with quantitative real time PCR (qPCR). To investigate the hypothesis that mutant BRAF overexpression represses PMCA4b, respective retroviruses were generated to establish wildtype and mutant BRAF overexpressing cancer cell lines. BRAF overexpression was confirmed by western blot and qPCR analysis. SA-ß-gal-staining was used to investigate senescence in mutant BRAF transduced melanoma cells. Results: Vemurafenib treatment increased the transcription of PMCA4b in melanoma cells with mutant BRAF in a cell line-dependent fashion. Valproic acid alone and in combination with vemurafenib enhanced PMCA4b expression in wildtype and mutant BRAF melanoma cells and increased intracellular IP3R channels and activator proteins of CRAC channels in melanoma cells with mutant BRAF. The combined effect suggests an enhanced release of ER-stored calcium by IP3R channels accompanied by an increased calcium clearance through PMCA4b calcium pumps. Mechanistically, downregulation of the AP1 complex element Fra1 upon vemurafenib treatment indicates a possible repression of PMCA4b expression by AP1 complexes downstream of mutant BRAF. In addition, increase of the melanogenesis-regulating transcription factor MITF by vemurafenib and valproic acid suggests reactivation of cell differentiation programs in melanoma cells. Conclusion: The results of this thesis show that vemurafenib or valproic acid and combination of both compounds induce expression changes of calcium channels and of the transcription factors Fra1 and MITF. Restored calcium homeostasis by inhibition of oncogenic BRAF and HDAC inhibition could play a role in suppression of melanoma metastasis.

Autor*innen

Matthias Wolf

Haupttitel (Englisch)

Regulation of calcium channel expression in melanoma cells with wildtype and mutant BRAF

Paralleltitel (Deutsch)

Regulierung der Expression von Calcium-Kanälen in Melanomzellen mit wildtype und mutiertem BRAF

Publikationsjahr

2016

Umfangsangabe

iv, 74 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Michael Grusch

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC13237910

Utheses ID

37386

Studienkennzahl

UA | 066 | 877 | |

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Schlagwörter