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Production and characterization of cellobiose dehydrogenase
Elisabeth Tomek
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Ernährungswissenschaften
Betreuer*in
Dietmar Haltrich
DOI
10.25365/thesis.42445
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-25380.76490.234069-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Flavoenzym Cellobiose Dehydrogenase (CDH) stammt aus holzzersetzenden Ascomyce-ten und Basidomyceten und findet vor allem in biotechnologischen Bereichen Verwendung.
Da die Erzeugung in Pilzen sehr komplex, mit einem hohen Aufwand, sowie mit enormen Kosten verbunden ist, wurde die Hefe Pichia pastoris als Expressionssystem gewählt. Das Enzym wird vorwiegend in der Analytik als Biosensor beispielsweise für die Quantifizierung von Laktose oder anderen Sacchariden eingesetzt. In der pharmazeutischen-, sowie in der Lebensmittelindustrie besteht ein starkes Interesse an der Laktobionsäure, die mittels der CDH produziert werden kann. Bei der Umsetzung aus Laktose wird das Enzym als Biokatalysator eingesetzt. Laktobionsäure hat einen mild-sauren Geschmack und wird in verschiedenen Medizinprodukten eingesetzt.
CDH vom Organismus Aspergillus oryzae Klasse II und Klasse III wurden erstmals im Rahmen dieser Masterarbeit produziert, gereinigt und charakterisiert.
Mit der CDH Klasse III wurde ein Substratscreening durchgeführt, um heraus zu finden mit welchem Substrat dieses Enzym aktiv ist. Um die besten Bedingungen der gereinigten CDH Klasse II zu bestimmen, wurden ein pH- Wert-, sowie ein Temperaturprofil erstellt. Weiters wurden mittels DCIP und cyt c Messungen kinetische Bestimmungen für Maltose, Laktose, Cellobiose und Glucose durchgeführt.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, eine Variante des Organismus Myriococcum thermo-philum mit Mutationen an den Positionen N700 und N784 zu produzieren. Dieses Enzym wurde gewählt, da es eine erhöhte O2 Aktivität hat und somit die H2O2 Produktion optimie-ren kann. Die Oxidation von Laktose zu Laktobionsäure durch den Einsatz dieser MtCDH wur-de charakterisiert. Es wurde auch getestet, ob eine Produktion von Maltobionsäure, Cellobi-onsäure und Gluconsäure mithilfe dieses Enzyms möglich ist.
Ein weiteres Ziel war es, das rekombinante Enzym für die Produktion von bakterienfreiem Joghurt einzusetzen. Zur Charakterisierung wurde ein Synärese Test durchgeführt, um die Textur mit einem konventionellen gerührten und einem gesetzten Joghurt zu vergleichen.
Es ist gelungen A. oryzae Klasse II und Klasse III zu produzieren. Auf die Ergebnisse der Cha-rakterisierung der Klasse II wird in dieser Arbeit ausführlich eingegangen. Für die Klasse III wurde im Substratscreening kein Substrat gefunden, welches mit diesem Enzym aktiv ist. Es wäre interessant ein anderes Expressionssystem oder eine Klasse III von einem anderen Pilz zu verwenden.
Analysen während der Umsetzung von Laktose zu Laktobionsäure haben gezeigt, dass die MtCDH aktiv war und dass die Konzentration der Laktose gesunken ist, währenddessen ist aber ist die Konzentration von Laktobionsäure angestiegen. Vergleichbare Ergebnisse konn-ten bei der Umsetzung von Cellobiose zu Cellobionsäure erzielt werden.
Weitere Experimente für die Produktion von Maltobionsäure und Gluconsäure wären von wissenschaftlichem Interesse.
Es ist gelungen während der Umsetzung von Laktose aus Kuhmilch zu Laktobionsäure mithil-fe des Biokatalysator MtCDH enzymatisches Joghurt zu produzieren.
Abstract
(Englisch)
The fungal enzyme cellobiose dehydrogenase (CDH) is a monomeric oxidoreductase, consisting of two domains connected by a flexible linker which is found in ascomycetes and basidiomycetes. CDH from different producers shows differences with respect to substrate specificity, pH-, and temperature optima. There is a high scientific interest in CDH because this enzyme has a wide spread field of application in the analytic area as well as in the industry. As CDH can be applied in food science, the production of lactobionic acid is of high importance for industrial applications. The production of CDH by fungi is very complex and expensive. Therefore the yeast Pichia Pastoris X33 was selected as expression system. The yeast species Pichia pastoris is frequently used as an expression system for recombinant protein production and is suitable for the production in shake flasks or in fermenters.
One class III CDH gene of Aspergillus oryzae was selected for recombinant production. This is the first time that a class III CDH was produced successfully. In this project the production process in shaking flasks and the purification of the enzyme is described in detail. Purification was done by Hydrophobic Interaction Chromatography and Anion Exchange Chromatography. After chromatography process a total protein yield of 6.91 mg was measured by Bradford assay. With the purified A. oryzae CDH III a substrate screening with cyt c and DCIP assay containing different mono-, di-, tri- and polysaccharides, alcohols and amino acids was done. There was no substrate, which showed any activity with the class III CDH. To compare the characteristics of class III CDH with class II, a class II CDH from A. oryzae was expressed and characterized. This enzyme was also produced in shaking flasks and purified with Hydrophobic Interaction Chromatography and Anion Exchange Chromatography. 3.20 mg of pure A. oryzae CDH II was produced successfully. To compare this enzyme with CDH from other organisms some characteristics were assessed. Kinetic measurements with this enzyme show that the most effective electron donor for A. oryzae CDH II is cellobiose. The optimal pH for this enzyme is at pH 5.0 for cyt c and for DCIP and the enzyme is best stable at 55 °C.
In general, CDH shows low activity with oxygen as electron acceptors and this hampers the in situ production of H2O2. In this work also describes the production process of Myriococcum thermophilum CDH with mutations at positions N700 and N748. This MtCDH variant was chosen because it has increased oxygen reactivity and thereby improves the hydrogen peroxide production. After the production in a fermenter, the purification was done by Hydrophobic Interaction Chromatography and Anion Exchange Chromatography. After purification a total protein yield of 10.7 mg was measured.
Furthermore, an efficient enzymatic bioprocess is described in which lactose converted into lactobionic acid by MtCDH without the formation of any by products in the bioreactor Sixfors. The conversion of lactose to lactobionic acid consists of the oxidation of the free aldehyde group of glucose on the lactose molecule to the carboxyl group. 15.78 g of lactobionic acid were produced successfully.
The oxidation of cellobiose, maltose and glucose by this CDH variant was also performed in the bioreacter system Sixfors. HPLC data show that the converting process of cellobiose into cellobionic acid worked successfully. Further experiments should optimize the production process of gluconic acid and maltobionic acid.
In a further experiment the recombinant MtCDH was used to produce bacteria free yoghurt. Mainly Streptococcus thermophiles and Lactobacillus bulgaricus are used as starter culture in conventionally yoghurt manufacture. The advantage of enzymatic yoghurt is that patients who are immunosuppressive could benefit from yoghurt which is produced with this MtCDH variant. The MtCDH catalysed oxidation of lactose in milk was performed by using the bioreacter system Sixfors. HPLC analyses have shown that lactose decreased during the production process. In the meantime the concentration of lactobionic acid increased. The product was stored for one week at 4 °C and during that time the texture became firmer. Texture is one of the most essential components of yoghurt quality. Therefore a syneresis test was done to compare the texture of a stirred-, set- and enzymatic yoghurt. Syneresis is an extraction of a liquid from a gel. During the syneresis process whey is collecting on the surface of the yoghurt. The texture from the enzymatic yoghurt is comparable with the stirred and set yoghurt but it is not proven yet whether the yoghurt is mutagenic in humans because a recombinant enzyme was used for the production.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Cellobiose Dehydrogenase Flavoenzyme Biosensor Oxidoreductase Lactobionic acid
Schlagwörter
(Deutsch)
Cellobiose Dehydrogenase Flavoenzym Biosensor Oxidoreduktase Laktobionsäure
Autor*innen
Elisabeth Tomek
Haupttitel (Englisch)
Production and characterization of cellobiose dehydrogenase
Paralleltitel (Deutsch)
Produktion und Charakterisierung von Cellobiose Dehydrogenase
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
87 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Dietmar Haltrich
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC13258778
Utheses ID
37563
Studienkennzahl
UA | 066 | 838 | |