Detailansicht
Functions of plectin and its isoforms assessed in mouse stratified epithelia and keratinocyte cell cultures
Gernot Walko
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Gerhard Wiche
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29357.81814.859561-0
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Plectin, ein Mitglied der Plakin-Proteinfamilie, ist ein großes und überaus vielseitiges Protein, das an der Bildung von zytoskelettären Strukturen und deren Verankerung an Zellmembranen entscheidend beteiligt ist. Es fungiert als Regulator der Aktin-Dynamik und spielt eine wesentliche Rolle in Epithelial-, Muskel- und Nervengeweben, was durch ausgeprägte Hautablösung auf hemidesmosomaler Ebene und pathologische Muskelveränderungen in Mäusen mit inaktiviertem Plectingen verdeutlicht wird. Ein ähnliches Erscheinungsbild tritt in Patienten auf, die an durch Defekte im Plectingen verursachter bullöser Epidermolysis mit muskulärer Dystrophie (EBS-MD) leiden. Plectin wird in Form einer Vielzahl von unterschiedlichen Isoformen exprimiert, die wahrscheinlich unterschiedliche Aufgaben erfüllen.
Im ersten Teil meiner Dissertation präsentiere ich die phänotypische Charakterisierung einer Mauslinie mit einer spezifischen Deletion von Plectin in mehrschichtigen Epithelgeweben. Konditionelle Deletion von Plectin erlaubte es mir, die Konsequenzen von Plectin-Defizienz in diesem speziellen Gewebstyp im Kontext des gesamten Organismus zu studieren. Die konditionellen knockout Mäuse starben früh nach ihrer Geburt, mit Anzeichen von Entkräftung und Wachstumsverzögerung. Blasenbildung konnte an ihren Extremitäten sowie auch am Schleimhautepithel der Mundhöhle nach initialem Säugen beobachtet werden. Die Ablösung des oralen Schleimhautepithels führte zu einer Beeinträchtigung der Nahrungsaufnahme. Die Epidermis der knockout Tiere war äußerst fragil und zeigte lokale Defekte in der Funktion der epidermalen Barriere. Diese Studie gibt eine Erklärung für die frühe Sterblichkeit von plectin-defizienten Mäusen und beinhaltet erste Daten über die induzierbare Deletion von Plectin in mehrschichtigen Epithelien von adulten Mäusen.
Im zweiten Teil zeige ich, dass Plectin-Defizienz zu einer anomalen Organisation des Keratinfilamentzytoskeletts, verursacht durch fehlende orthogonale Quervernetzung von Keratinintermediärfilamenten, in kultivierten Keratinozyten führt. Das hemidesmosomale Integrin alpha6beta4 Heterodimer war in Plectin-defizienten Keratinozyten nicht mit Keratinfilamenten assoziiert, sondern in Lamellipodien umgelagert. Die basale Aktivität der MAP Kinasen Erk1/2, der membranassoziierten upstream Proteinkinase PKCdelta, sowie von Kinasen der Src-Familien Kinasen waren in Plectin-defizienten Keratinozyten signifikant erhöht. Des Weiteren beobachtete ich erhöhte Migrationsraten von Plectin-defizienten Keratinozyten mittels in vitro Wundheilungsassays und time-lapse Videomikroskopie. Diese Daten offenbaren eine Verbindung zwischen Zytolinker-kontrollierter Zytoarchitektur und der Gerüstfunktion von Keratin-Intermediärfilamenten mit spezifischen MAP Signalkaskaden.
Im dritten Teil meiner Dissertation charakterisiere ich die Interaktion der Plectin Isoform 1c mit Mikrotubuli auf funktioneller und mechanistischer Ebene. Plectin 1c war am kortikalen submembranen Zytoskelett von polarisierten neuronalen Zellen und Keratinozyten, sowie auch an Mikrotubuli lokalisiert. Die Bindung an Mikrotubuli hing von Plectin 1c-spezifischen N-terminalen Sequenzen ab. Die Hauptisoform in Keratinozyten, Plectin 1a, welche keine Plectin 1c-spezifischen Sequenzen enthielt, interagierte weder in vivo noch in vitro mit Mikrotubuli. Weiters zeigte ich, dass eine mutmaßliche SH3 Domäne, welche sich innerhalb von Plectins Plakin-Domäne befindet, in vitro an Mitglieder der MAP2/tau Familie von mikrotubuliassoziierten Proteinen binden konnte. Aufgrund der Wichtigkeit von Plectin für die Aufrechterhaltung der Integrität von epithelialen Geweben wurde die Rolle von Plectin während der kalziuminduzierten Differenzierung von Keratinozyten analysiert. Interessanterweise fand ich, dass das Fehlen von Plectin zu einer abnormalen dichten Bündelung sowie einer Zunahme der Stabilität von Mikrotubuli führte. Basierend auf diesen Ergebnissen schlage ich ein Modell vor, in welchem Plectin 1c mittels unterschiedlicher N-terminaler Sequenzen an Mikrotubuli lokalisiert und deren Dynamik durch Modulation der Mikrotubuli-Bindung von mikrotubuliassoziierten Proteinen der MAP2/tau Familie beeinflusst.
Im vierten Teil analysiere ich den Mechanismus des reduzierten Migrationspotentials von Plectin-defizienten Fibroblasten. Ich fand, dass das PKC-regulatorische Protein RACK1 stark am Lamellipodiensaum von Plectin-defizienten Fibroblasten lokalisiert war. Damit einhergehend beobachtete ich erhöhte Enzymaktivität von PKCdeltain diesen Zellen. Diese Daten zeigen, dass Plectin-Defizienz ähnliche Auswirkungen auf die RACK1/PKCdelta Signaltransduktion in Keratinozyten und in Fibroblasten hat. Gleichzeitig scheint aber die Hyperaktivierung von RACK1/PKCdelta die Zellmigration in einer, dem Zelltyp entsprechenden Art und Weise, zu beeinflussen.
Abstract
(Englisch)
Plectin is a major intermediate filament (IF)–based cytolinker protein that stabilizes cells and tissues mechanically, regulates actin filament dynamics, and serves as a scaffolding platform for signaling molecules. The importance of plectin for tissue integrity was demonstrated in plectin knockout mice which die early after birth, exhibiting severe skin blistering defects and abnormalities in skeletal and heart muscle, similar to the disorders found in patients suffering from epidermolysis bullosa simplex with muscular dystrophy (EBS-MD), which is caused by various mutations in the plectin gene. In the 5´-prime region of the plectin gene complex splicing takes place, giving rise to several alternatively spliced transcripts containing different first exons. It has been proposed that plectin fulfils a variety of distinct functions presumably mediated by different isoforms.
In the first part of this thesis, I present the phenotypic characterization of a mouse line with a specific deletion of plectin in stratified epithelia. Conditional targeting of plectin enabled me to study the consequences of plectin deficiency in this particular type of tissues in the context of the whole organism without plectin loss affecting other tissues. Conditional knockout mice died early after birth, showing signs of starvation and growth retardation. Blistering was observed on their extremities and on the oral epithelium after initial nursing, impairing food uptake. Knockout epidermis was very fragile and showed focal epidermal barrier defects caused by the presence of small skin lesions. Stratification, proliferation and differentiation of knockout skin seemed unaffected by epidermis-restricted plectin deficiency. In an additionally generated mouse model, tamoxifen-induced Cre-ERT-mediated recombination led to mice with a mosaic plectin deletion pattern in adult epidermis, combined with microblister formation. This study explains the early lethality of plectin-deficient mice and provides a model to ablate plectin in adult animals which could be used for developing gene or pharmacological therapies.
In the second part of my thesis it is shown that plectin deficiency in cultured keratinocytes is a cause of aberrant keratin cytoskeleton organization caused by a lack of orthogonal IF cross-linking. Keratin association of the hemidesmosomal integrin alpha6beta4 is lost in plectin-deficient keratinocytes, and the integrin relocates to lamellipodia. Basal activities of the MAP kinase Erk1/2 and of membrane-associated upstream protein kinases PKCdelta and Src-family kinases were significantly elevated in plectin-deficient keratinocytes, and increased migration rates, as assessed by in vitro wound-closure assays and time-lapse microscopy, were observed. These data establish a link between cytolinker-controlled cytoarchitecture/scaffolding functions of keratin IFs and specific MAP kinase cascades mediating distinct cellular responses.
In the third part, the interaction of plectin isoform 1c with microtubules is addressed on functional and mechanistic levels. Plectin 1c is localized at the cortical submembrane cytoskeleton of polarized neuronal cells and keratinocytes, and in addition, distributes along microtubules. Microtubule binding depends on plectin 1c-specific N-terminal sequences, since plectin 1a, the major isoform found in keratinocytes, did associate with microtubules neither in vivo nor in vitro. It is demonstrated that a putative SH3 domain residing within plectin`s plakin domain is able to mediate binding to members of the MAP2/tau family of microtubule-associated proteins in vitro. Because of the importance of plectin for maintaining epithelial tissue integrity, the role of plectin-microtubule interaction during Ca2+-induced differentiation of cultured keratinocytes was investigated. Interestingly, I found that the absence of plectin led to abnormally dense packing and increased stability of microtubules. Based on these results, I propose a model where plectin 1c is targeted to microtubules via different N-terminal sequences and regulates MT dynamics by modulating MT-binding of microtubule associated proteins of the MAP2/tau family.
Studies described in the final part give insight into the molecular mechanism causing the reduced migration potential of plectin-deficient fibroblasts. I found that the PKC regulatory protein RACK1 (receptor for activated C kinase 1) was strongly accumulated at lamellipodial edges of migrating plectin-deficient fibroblasts. Concomitantly, elevated enzymatic activity of PKCdelta was observed in these cells. These data show that plectin-deficiency has similar consequences on RACK1/PKCdeltasignaling in keratinocytes and fibroblasts, but hyperactivation of RACK1/PKCdelta appears to affect cell migration in a cell type specific manner.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
plectin plakin conditional knockout keratinocytes epidermis hemidesmosomes EBS-MD cytoskeleton
Schlagwörter
(Deutsch)
Plectin Plakin konditioneller knockout Keratinozyten Epidermis Hemidesmosomen EBS-MD Zytoskelett
Autor*innen
Gernot Walko
Haupttitel (Englisch)
Functions of plectin and its isoforms assessed in mouse stratified epithelia and keratinocyte cell cultures
Paralleltitel (Deutsch)
Analyse der Funktion von Plectin und seinen Isoformen in stratifizierten Mausepithelien und kultivierten Keratinozyten
Publikationsjahr
2007
Umfangsangabe
getr. Zählung
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Roland Foisner ,
Milos Pekny
AC Nummer
AC05036317
Utheses ID
376
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |