Detailansicht

Proteomics in immunity
regulatory functions of tyrosine kinase 2 on protein expression in macrophages
Marta Radwan
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Thomas Decker
Volltext herunterladen
Volltext in Browser öffnen
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.4252
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30033.98320.184653-6
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Tyrosinkinase 2 (Tyk2) gehört zur Familie der Janus Kinasen (Jak). Tyk2 wurde ursprünglich als essentielle Komponente in der Typ-I Interferon (IFN) Signaltransduktions-Kaskade identifiziert und ist in die Signaltransduktion vieler weiterer Zytokine und einiger Wachstumsfaktoren involviert. Tyk2-defiziente Mäuse zeigen erhöhte Sensitivität bei Infektion mit vielen unterschiedlichen Pathogenen (z.B. Maus Cytomegalovirus, Listeria monocytogenes). Im Gegensatz dazu sind sie resistent gegen Lipopolysaccharid (LPS)- und Ischämie/Reperfusion-induzierten septischen Schock. Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Erkennung von und der Antwort auf LPS und somit in der Pathogenese des septischen Schocks. Makrophagen zeigen in Abwesenheit von Tyk2 eine reduzierte Aktivierung der IFN-Signaltransduktion nach Behandlung mit LPS und folglich eine erniedrigte Expression zumindest mancher IFN-induzierbarer Gene. Ziel dieser Arbeit war es, die molekulare Rolle von Tyk2 in Makrophagen detaillierter zu untersuchen, wobei der Fokus auf die Ermittlung von neuen, Tyk2-abhängigen Antworten der Wirtszellen gelegt wurde. Ein Proteomics-Ansatz zur vergleichenden Analyse von Proteinmustern in Zelllysaten von Wildtyp- versus Tyk2-defizienter primärer Makrophagen wurde ausgewählt. Als zentrale Technik hierfür wurde zweidimensionale „Fluorescence Difference Gel Electrophoresis“ (2D-DIGE) verwendet. Experimentelle Bedingungen für die spezifischen Probentypen wurden optimiert und die Reproduzierbarkeit sowie die minimal detektierbaren Unterschiede statistisch ermittelt. Diese optimierte Methode wurde dann eingesetzt, um Kandidaten für die massenspektrometrische Identifizierung zu ermitteln. Wir konnten zeigen, dass die Proteinmuster in Gesamtzell- und Kern-Lysaten zwischen Wildtyp- und Tyk2-defizienten Knochenmark-Makrophagen, sowohl vor als auch nach der Behandlung mit LPS, signifikant unterschiedlich sind. In 27 differentiell exprimierten Spots wurden mittels Massenspektrometrie 23 verschiedene Proteine identifiziert. Diese Proteine gehören zu diversen funktionellen Klassen (z.B. Immunantwort, oxidative Stressantwort, Apoptose, Metabolismus und Transkription/Translation) und ihre Expression ist durch Tyk2 entweder positiv oder negativ reguliert. Weitere detaillierte Untersuchungen an ausgewählten Proteinen ergaben, dass Tyk2 die Proteinexpression auf mRNA- und/oder Proteinebene beeinflusst. Mittels 1D und 2D Westernblot Analysen fanden wir, dass Tyk2 die LPS-abhängigen Veränderungen im Proteinmuster von Peroxiredoxin 1 (PRDX1), nicht aber dessen Gesamtproteinmenge, beeinflusst. Die subzelluläre Verteilung von Elongationsfaktor 2 (EF2) scheint abhängig von Tyk2 zu sein, da Genotyp-spezifische Unterschiede nur in Kern- und nicht in Gesamtlysaten detektierbar sind. Wir konnten weiters zeigen, dass Tyk2 die Expression von Plasminogen Activator Inhibitor 2 (PAI2) und pro-Interleukin-1beta (pro-IL-1beta) Protein, nicht aber deren mRNAs, negativ reguliert. Im Gegensatz dazu ist die Anwesenheit von Tyk2 für eine effiziente mRNA Expression von N-myc Interactor (NMI) erforderlich, dessen transkriptionelle Regulation durch IFNs bekannt ist. Die Tatsache dass IL-1beta eine wichtige Rolle in der Immunität spielt und seine Expression bisher nicht in direkten Zusammenhang mit Tyk2 gebracht wurde, hat uns veranlasst den molekularen Mechanismus der erhöhten pro-IL-1beta Proteinexpression näher zu analysieren. Wir konnten zeigen, dass die erhöhte intrazelluläre Menge von pro-IL-1beta nicht durch defekte Prozessierung und/oder Sekretion verursacht wird und dass in Abwesenheit von Tyk2 auch die extrazelluläre Menge von IL-1beta erhöht ist. Die Analyse des Proteinabbaus nach der Applikation des translationellen Inhibitors Cycloheximid oder einer radioaktiven Protein-Markierung ergab, dass die Stabilität von pro-IL-1beta in beiden Genotypen ähnlich ist. Interessanterweise beobachteten wir eine erhöhte Assoziation der IL-1beta mRNA mit Polysomen in Abwesenheit von Tyk2. Dies lässt Differenzen in der translationellen Effizienz und eine neue Rolle von Tyk2 in der translationellen Kontrolle annehmen. Zusammenfassend zeigen wir, dass mittels 2D-DIGE mit unserem experimentellen Aufbau eine hohe Reproduzierbarkeit erzielt wird. Durchschnittlich können signifikante Unterschiede in der Proteinexpression schon ab 30% Differenz in Zelllysaten primärer Makrophagen festgestellt werden. In Bezug auf Tyk2 weisen unsere Ergebnisse auf einen regulativen Einfluss auf mehrere Ebenen der Proteinexpression und auf neue Zusammenhänge zwischen Tyk2 und diversen zellulären Proteinen hin.
Abstract
(Englisch)
Tyrosine kinase 2 (Tyk2) is a member of the Janus kinase (Jak) family and was originally identified by its essential role in type I interferon (IFN) signalling. Tyk2 is involved in signal transduction via various cytokines and some growth factors. Tyk2-deficient mice show increased sensitivity to infection with a number of different pathogens (e.g. Murine Cytomegalovirus, Listeria monocytogenes). In contrast, they show high resistance to lipopolysaccharide- (LPS) and ischemia/reperfusion-induced shock. Macrophages play a crucial role in the recognition of and response to LPS, and consequently, in the pathogenesis of endotoxin shock. In the absence of Tyk2, macrophages show a decreased activation of the IFN signalling cascade upon LPS treatment and, accordingly, reduced induction of at least some IFN target genes. Aim of this study was to investigate the molecular role of Tyk2 in macrophages in more detail with the main focus on the identification of novel Tyk2-dependent host cell responses. A proteomic approach was chosen for the comparative analysis of protein patterns in lysates from wild-type (WT) versus Tyk2-deficient primary macrophages. The key method was two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) using minimal labelling with cyanine dyes. Experimental conditions for the specific sample type were optimised and reproducibility and the minimal detectable differences (effect size) were determined by statistical analyses. The method was applied to select candidates, which were then subjected to identification by mass spectrometry. We could show that protein patterns in whole cell lysates and nuclear extracts are significantly different between WT and Tyk2-deficient bone marrow-derived macrophages (BMM) both in the LPS-treated and the untreated state. Twenty-three different proteins derived from 27 differentially expressed spots were identified by mass spectrometry. The identified proteins belong to distinct functional categories (e.g. immune response, oxidative stress response, apoptosis, metabolism, and transcription/translation) and their expression is either positively or negatively regulated by Tyk2. More detailed analysis of selected proteins revealed that Tyk2 influences protein expression at the mRNA and/or at the protein level. We show that Tyk2 influences LPS-dependent changes in the peroxiredoxin 1 (PRDX1) spot pattern but not the total PRDX1 expression level, as displayed by 1D and 2D western blot analysis. Subcellular distribution of elongation factor 2 (EF2) appeared dependent on Tyk2, since genotype specific differences were only detected in nuclear but not in whole cell extracts. We could furthermore show that Tyk2 negatively regulates plasminogen activator inhibitor 2 (PAI2) and pro-interleukin-1beta (pro-IL-1beta) protein but not mRNA expression. In contrast, N-myc interactor (NMI), a protein known to be transcriptionally regulated by IFN, was dependent on the presence of Tyk2 for efficient mRNA and protein expression. Since IL-1beta plays an important role in immunity and Tyk2 has not yet been linked to IL-1beta expression, we further analysed the mechanistic basis of enhanced pro-ILbeta protein expression in Tyk2-deficient macrophages. We could show that enhanced levels of intracellular pro-IL-1beta are not due to defective processing and/or secretion and that also extracellular IL-1beta is enhanced in the absence of Tyk2. Similar protein stability in both genotypes could be demonstrated by using the translational inhibitor cycloheximide and monitoring pro-IL-1beta degradation and pulse/chase labelling experiments. Interestingly, we found increased association of IL-1beta mRNA with polysomes in the absence of Tyk2, arguing for differences in translational efficiency and suggesting a novel role of Tyk2 in translational control. In summary, we show that high reproducibility can be achieved with 2D-DIGE technology with the developed experimental set-up. Detection of differences in protein expression in cell lysates derived from primary macrophage cultures of as low as 30% (on average) could be demonstrated. With respect to Tyk2, our results imply regulatory roles of Tyk2 at multiple levels of protein expression and establish novel connections between Tyk2 and several cellular proteins.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
tyrosine kinase 2 lipopolysaccharide macrophages innate immunity proteomics Jak-Stat signalling interferon two-dimensional gel electrophoresis two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis
Schlagwörter
(Deutsch)
Tyrosinkinase 2 Lipopolysaccharid Makrophagen angeborene Immunitaet zweidimensionale Gelelektrophorese Proteomik Jak-Stat-Signalweg zweidimensionale "Fluorescence Difference Gel Electrophoresis" Interferon
Autor*innen
Marta Radwan
Haupttitel (Englisch)
Proteomics in immunity
Hauptuntertitel (Englisch)
regulatory functions of tyrosine kinase 2 on protein expression in macrophages
Paralleltitel (Deutsch)
Proteomik in der Immunitaet ; regulatorische Funktionen der Tyrosinkinase 2 auf die Proteinexpression in Makrophagen
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
124 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Hartmut Hengel ,
Ernst Müllner
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC05039929
Utheses ID
3766
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1