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Transgene expression and plant regeneration in the Brassicaceae Aethionema arabicum

David Schlager

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Botanik

Betreuer*in

Ortrun Mittelsten Scheid

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DOI

10.25365/thesis.42754

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-28694.03872.415459-4

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Transformation, der Einbau zusätzlicher DNA Abschnitte, ist eines der wichtigsten Werkzeuge in der modernen Molekularbiologie and Genetik, um Pflanzengenome modifizieren und folglich die Funktion und Regulation ausgewählter Gene studieren zu können. Verschiedene Techniken wurden entwickelt, mit denen unzählige Pflanzenarten für die Grundlagenforschung, aber auch für die moderne Landwirtschaft, transformiert werden konnten. Die annuelle Pflanze Aethionema arabicum, wie die Modellpflanze Arabidopsis thaliana eine Vertreterin der Familie der Brassicaceae, bildet zwei verschiedene Frucht- und Samentypen auf demselben Individuum aus; bekannt als Heterokarpie. Um die zugrundeliegenden molekularen Zusammenhänge dieser Heteromorphie in Verbindung mit der Anpassung an stark schwankende Umweltbedingungen verstehen zu können, stellt die Transformation ein wichtiges Werkzeug dar, diese molekularen Prozesse zu studieren. Im Zuge dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden angewendet, die bereits in anderen Pflanzenarten zu einer erfolgreichen Tranformation geführt haben. Grundsätzlich kann zwischen einer Agrobacterium-vermittelten Transformation und einer biolistischen Transformation unterschieden werden, um Fremd-DNA in das Pflanzengenom zu integrieren. Das für A. thaliana entwickelte Protokoll der „Floral Dip“ Methode wurde für Aethionema mit einem Markergen getestet, welches GFP direkt im Samen exprimieren sollte. Aufgrund hoher Autofluoreszenz der Samen im GFP Absorptionsspektrum war dieser Ansatz nicht erfolgreich. Jedoch konnte eine transiente GFP Expression in einzelnen Zellen des jeweiligen Gewebeverbands mit zwei anderen Methoden erreicht werden: zum einen durch eine Agrobacterium-Infiltration von Blattgewebe (leaf infiltration) und zum anderen über einen biolistischen Ansatz, indem Plasmid-DNA verbunden mit Goldpartikeln auf Hypokotylgewebe von Keimlingen geschossen wurde (particle bombardment). Die Expression hielt in der Regel einige Tage an, und der Wirkungsgrad war vom verwendeten Konstrukt sowie vom Agrobacterium Stamm abhängig. Virus-induced gene silencing (VIGS) ist ein System, um gezielt Transkripte in Zellen herunterzuregulieren. Das verwendete Tobacco Rattle Virus (TRV) mit einem eingebauten Phytoenedesaturase Insert bewirkt eine Ausbleichung der Blätter in Nicotiana benthamiana. Diese Kombination wurde in dieser Arbeit erfolgreich als Kontrolle verwendet. Für Ae. arabicum konnte ein solcher Bleichungseffekt nicht nachgewiesen werden, jedoch wurde in einem der beiden Ökotypen eine veränderte Morphologie des Hauptsprosses beobachtet, wenn das Gen Indehiscent (IND) als potentielles Target für die Inaktivierung bereitgestellt wurde. Die Präsenz der viralen RNA in der Pflanze sowie die Reduktion des IND Transkripts bleiben zu bestätigen, bevor Schlussfolgerungen gezogen werden können. Der vielversprechendste Ansatz jedoch scheint über eine Gewebekultur von jungem Hypokotylgewebe zu funktionieren. Mittels einer Co-Kultivierung mit Agrobacterium wurde eine Expression von diversen Markergenen in induziertem Kallus erreicht, welche über Monate hinweg beibehalten werden konnte. Zusätzlich wuchs der Kallus auf einem Hygromycinmedium, was die Expression des entsprechenden Resistenzgens vermuten ließ. Eine stabile Integration in das Pflanzengenom muss jedoch erst mit einem Southern Blot bestätigt werden. Außerdem muss ein Regenerationsprotokoll entwickelt werden, um aus dem Kallus schließlich fruchtbare Pflanzen zu erhalten. Nichtsdestoweniger konnten in einer in vitro Kultur mit entsprechend hohen Mengen des Pflanzenhormons Zytokinin Sprosse aus Blattschnitten generiert werden. Die Etablierung von möglichen Markergenen und Konstrukten sowie Protokolle für die transiente Expression nach Co-Kultivierung mit Agrobacterium und für die Regeneration von Sprossen aus Blattschnitten bilden eine vielversprechende Basis, diese Ansätze zu verbinden, stellen wichtige Schritte auf dem Weg zu transgenen Aethionema Pflanzen dar.

Abstract

(Englisch)

A major tool in plant reverse genetics is transformation, stably introducing foreign genes of interest into the genome. Many techniques are available to do so, and over the last decades, plenty of plant species were successfully transformed, for basic research as well as for crop design by genetic engineering. The plant Aethionema arabicum, like the well-established model plant Arabidopsis thaliana a member of the genus Brassicaceae, shows two distinct fruit and seed morphs on the same individual plant, described as heterocarpy. To understand the molecular mechanism of heterocarpy and its role in adaptation to unpredictable environment, transformation of this species is an essential tool to study the underlying molecular pathways. In this context, several well-known transformation techniques, already applied for many different plant species, were tested in order to generate transgenic Ae. arabicum. The techniques are based on either an Agrobacterium-mediated transformation approach or on a biolistic method to introduce foreign DNA into the plant cells. The floral dip protocol, which is commonly used in Arabidopsis genetics, was tried with a marker gene that would express GFP in transgenic seeds. This attempt was not successful due to high autofluorescence in seeds even in the absence of the GFP marker gene. However, leaf infiltration and particle bombardment with constructs designed for constitutive expression of GFP allowed detection of transiently expressed GFP in different plant tissues, with different efficiencies dependent on the constructs and Agrobacterium strains. Virus-induced gene silencing (VIGS) with the Tobacco Rattle Virus (TRV) and targeting phytoene desaturase (PDS) was successfully tested in N. benthamiana as a proof of concept, resulting in photobleaching in the entire plant due to PDS transcript degradation. When the Aethionema PDS was inserted into the viral constructs and tested for VIGS in Aethionema plants, no bleaching was observed. However, corresponding silencing of the indehiscent gene (IND) as target led to a modified phenotype in some plants. Presence of the viral RNA and down-regulation of the IND transcript remain to be confirmed. The most promising method turned out to be the co-cultivation of young hypocotyl explants with Agrobacterium and subsequent plant regeneration. Transgene-expressing hypocotyl callus could be propagated over a long time and grown on selective medium. However, stable integration of the marker gene into the plant genome has yet to be confirmed by performing a Southern blot, while also a regeneration protocol for fertile plants has still to be established. Nevertheless, successful shoot differentiation from non-transgenic mature leaves could be achieved on medium with high amounts of cytokinin. 56 Altogether, the establishment of suitable marker genes and constructs, protocols for transient transgene expression after co-cultivation with Agrobacterium and regeneration of shoots from leaf explants provide a promising basis to combine these different elements on the way towards transgenic Aethionema.

Autor*innen

David Schlager

Haupttitel (Englisch)

Transgene expression and plant regeneration in the Brassicaceae Aethionema arabicum

Paralleltitel (Deutsch)

Expression von Transgenen und Pflanzenregeneration in Aethionema arabicum (Brassicaceae)

Publikationsjahr

2016

Umfangsangabe

58 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Ortrun Mittelsten Scheid

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.20 Genetik ,

42 Biologie > 42.43 Pflanzengenetik ,

42 Biologie > 42.56 Angiospermae

AC Nummer

AC13260029

Utheses ID

37846

Studienkennzahl

UA | 066 | 832 | |

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