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In-depth mass spectrometry-based proteome profiling of inflammation-related processes
Andrea Bileck
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (Dissertationsgebiet: Chemie)
Betreuer*in
Christopher Gerner
DOI
10.25365/thesis.42789
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-25382.34853.437253-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Entzündungsprozesse sind die Folge von physiologisch essentiellen Abwehrstrategien höherer
Organismen gegen Pathogene. Diese Prozesse sind durch ein komplexes Zusammenspiel
unterschiedlichster Zelltypen charakterisiert, dem ein Netzwerk verschränkter
Signaltransduktionswege zugrunde liegt. Massenspektrometrie-basierende Proteomanalysen wurden
zur Untersuchung der zellulären Prozesse während entzündlicher Stimulation und auch der zellulären
Reaktion auf anti-entzündliche Wirkstoffe eingesetzt. Als biologisch relevantes in vitro Modell wurden
primäre humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes herangezogen, welche mit
Lipopolysaccharid und Phytohämagglutinin entzündlich stimuliert wurden. In weiterer Folge wurden
die Effekte von Dexamethason und dem synthetischen Cannabinoid CP47,497-C8 auf die
Entzündungsprozesse untersucht. Die Behandlung entzündlich stimulierter Zellen mit Dexamethason
wurde durchgeführt um einerseits Einblicke in anti-entzündliche Mechanismen zu erhalten und
andererseits die Fähigkeit des Medikamentes pro-entzündliche Zellaktivitäten zu unterbinden, zu
evaluieren. Die Behandlung von ruhenden Zellen mit dem synthetischen Cannabinoid hingegen zeigte
die besondere Eignung des Verfahrens, die Beeinflussung von Entzündungsprozessen auch aufgrund
von nicht-klassischen Stimulantien genau untersuchen zu können. Die zellulären Proben wurden in
zytoplasmatische Protein, Kernproteine und sezernierte Proteine aus dem Zellüberstand fraktioniert
und enzymatisch verdaut. Umfassende Proteomprofile wurden mit Hilfe eines hochauflösenden
QExactive Orbitrap Massenspektrometers und der MaxQuant-Software erstellt.
Vergleichende Proteomanalysen von ruhenden und entzündlich stimulierten mononukleären Zellen des
peripheren Blutes ergaben die Identifikation von 85501 unterschiedlichen Peptiden, die zur
Identifikation von 6886 Proteinen führte. Davon waren 469 Proteine durch die entzündliche
Stimulation signifikant reguliert, unter anderem auch die klassischen entzündlichen Mediatoren IL-1β,
IL-6, CXCL2 und GROα. Es konnte auch gezeigt werden, dass Dexamethason nicht in der Lage ist,
alle durch entzündliche Stimulation hoch regulierten Proteine wieder hinunter zu regulieren. Basierend
auf der hohen Datendichte konnte der gesamte c-JUN, ERK5 und NF-κB Signalweg semiquantitativ
abgebildet werden. Des Weiteren konnten 2731 Phosphopeptide, welche von 991 Proteinen stammen,
mit hoher Sicherheit erfasst werden. Aufgrund der effizienten subzellulären Fraktionierung war es
auch möglich Entzündungs-assoziierte Translokations-Ereignisse in den Zellkern von beispielsweise
Histon-modifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren zu verfolgen. Schließlich zeigt diese
Arbeit nicht nur die Leistungsfähigkeit von Massenspektrometrie-basierenden Analysestrategien
hinsichtlich der Identifikation von Proteinen, sondern auch bezüglich der Untersuchung von
Proteinregulationen, post-translationalen Modifikationen und Kerntranslokation von Proteinen, welche
zur detaillierten Charakterisierung von komplexen Mechanismen im Rahmen von
Entzündungsprozessen erforderlich sind.
Abstract
(Englisch)
Inflammatory responses are indispensable physiological processes involved in the defense mechanism
of an organism. These processes are characterized by a complex interplay of different types of immune
cells with an underlying network of intersecting signaling pathways. Mass spectrometry-based
proteomics analysis was applied in order to investigate cellular processes during inflammatory
stimulation as well as in response to therapeutic interventions. As a highly relevant in vitro model
system, primary human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were chosen, which were
inflammatory stimulated using lipopolysaccharide and phytoheamagglutinin. Furthermore, cells were
treated with dexamethasone and the synthetic cannabinoid CP47,497-C8, respectively. The treatment
of inflammatory activated PBMCs with dexamethasone was performed to obtain insight into antiinflammatory
mechanisms induced by drug treatment and to investigate its potency to suppress proinflammatory
cellular activities. In contrast, the assessment of CP47,497-C8-treated quiescent PBMCs
demonstrated the power of this analysis strategy to disclose inflammation-related processes
independent of a classical inflammatory stimulus. Cellular samples were fractionated into supernatant,
cytoplasmic and nuclear protein fractions and subsequently enzymatically digested. Comprehensive
proteome profiles were then generated using a high resolution QExactive orbitrap mass spectrometer
and label-free quantitative data analysis was performed using MaxQuant.
Comparative proteome profiling of quiescent and inflammatory activated PBMCs revealed the
identification of 85501 peptides compiled to 6886 proteins. Thereof, 469 proteins were significantly
regulated upon inflammatory activation including the classical inflammatory mediators IL-1β, IL-6,
CXCL2 and GROα. Furthermore, it was clearly demonstrated that dexamethasone is unable to
counter-regulate all inflammation-induced proteins. Based on the high data density, the entire c-JUN,
ERK5 and NF-κB signaling cascade was mapped in a semi-quantitative fashion. Furthermore, 2731
phosphopeptides derived from 991 proteins were identified in a highly confident fashion. Due to the
efficient subcellular fractionation it was further possible to assess inflammation-related nuclear
translocation of proteins, for example of histone-modifying proteins and transcription factors. In
conclusion, this thesis demonstrates the power of mass spectrometry-based proteomics regarding not
only the identification of proteins, but also the assessment of protein regulations, post-translational
modifications and nuclear translocation events in order to comprehensively characterize the complex
molecular processes during inflammation.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
mass spectrometry proteomics primary human peripheral blood mononuclear cells inflammation drug treatment
Schlagwörter
(Deutsch)
Massenspektrometrie Proteomik primäre humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes Entzündung Medikamentbehandlung
Autor*innen
Andrea Bileck
Haupttitel (Englisch)
In-depth mass spectrometry-based proteome profiling of inflammation-related processes
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
II-X, 149 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Ruth Birner-Grünberger ,
Rudolf Oehler
AC Nummer
AC13294871
Utheses ID
37878
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |