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The impact of deoxynivalenol (DON) amd its metabolites DON-3-sulfate and DON-15-sulfate on the human colorectal adenocarcinoma cell line HT-29
Lydia Wölflingseder
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Lehramtsstudium UF Chemie UF Italienisch
Betreuer*in
Doris Marko
DOI
10.25365/thesis.42790
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-25380.87347.531153-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Typ B Trichothecene Deoxynivalenol (DON) ist ein sehr bekanntes Mykotoxin, welches als Stoffwechselprodukt von verschiedenen Pilzarten der Gattung Fusarium produziert wird und dadurch als Kontaminant in verschiedenen Nahrungs- und Futtermittel, vor allem jedoch auf befallenem Getreide und daraus verarbeiteten Produkten vorkommt. Neben vielen weiteren toxischen Effekten führt die Einnahme akut toxischer Dosen von DON in Menschen und Tieren zu starker Übelkeit und Erbrechen (Forsyth et al., 1977), weshalb gemäß des Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) eine provisorische maximal tolerable tägliche Aufnahme von 1 µg pro kg Körpergewicht für DON und dessen acetylierte Metabolite festgelegt wurde (Food and Agriculture Organisation and World Health Organisation (FAO/WHO), 2002). Eine biologische Charakterisierung von zwei erst kürzlich identifizierten DON Metaboliten, DON-3-Sulfat und DON-15-Sulfat (Warth et al., 2015), welche ähnliche biologische Aktivitäten wie DON aufweisen könnten, ist deshalb von großer Bedeutung um deren toxikologische Relevanz evaluieren zu können.
Im Zuge dieser Diplomarbeit wurde demnach, unter Berücksichtigung der bereits vorhandenen Datenlage zu DON, eine initiale Charakterisierung der biologischen Aktivität von DON-3-Sulfat und DON-15-Sulfat vergleichend zu DON in der humanen Colon-Adenokarzinom Zelllinie HT-29 durchgeführt. Zu Beginn wurde der Einfluss von DON und dessen Sulfo-Metaboliten auf die zelluläre Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im Dichlorofluorescein-Assay erhoben. DON (10 µM) und DON-3-Sulfat (1 und 10 µM) zeigten dabei eine sehr rasche und kurzweilige Reaktion und führten zu einem signifikanten Anstieg des intrazellulären, oxidativen Stresslevels nach drei Minuten Inkubationszeit, wohingegen DON-15-Sulfat (10 µM) erst nach drei Stunden Inkubation zu einem leichten Anstieg von ROS führte.
Um darüber hinaus den Einfluss dieses leicht erhöhten oxidativen Stresslevels auf Zytotoxizität, Zellviabilität und zelluläre mitochondriale Aktivität zu erheben, wurden die Substanzen weiter im SRB Assay, WST-1 Assay und mittels Konfluenzanalyse untersucht. Inkubationen mit DON resultierten dabei in einer zweiphasigen Reaktion, in welcher 0,1 µM DON zu erhöhter Zellproliferation führte, 10 µM und höhere DON Konzentrationen jedoch bereits nach 24 Stunden zytotoxische Effekte hervorriefen. Um die erhobenen Zytotoxizitäts- und Proliferationsdaten zu bestätigen bzw. zu unterstützen, wurden weiters immunzytochemische Analysemethoden unter Einsatz von Konfokal-Mikroskopie verwendet und eine Quantifizierung des Proliferationsmarkers KI-67 und von Zellen in aktiver Mitose durchgeführt.
In dem für diese Diplomarbeit gewählten, experimentellen Rahmen zeigten die beiden Sulfo-Metabolite DON-3-Sulfat und DON-15-Sulfat kein dem DON ähnliches toxikologisches Verhalten. Deren starker Einfluss auf Zellproliferation und Viabilität in HT-29 Zellen eröffnet jedoch einen ersten Einblick in die toxikologische Wirkungsweise der Sulfate und darüber hinaus, neben ersten Ansätzen in Bezug auf Risikobewertung, auch die Basis für weiterführende Forschungsfelder.
Abstract
(Englisch)
Deoxynivalenol (DON) is a natural-occurring type B trichothecene mycotoxin mainly produced by certain Fusarium spp. which colonise worldwide food and feed. Thus DON constitutes a major issue for global food an feed safety and a provisional maximum tolerable daily intake (PMTDI) of 1 µg/kg body weight was established by the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) in 2001 (Food and Agriculture Organisation and World Health Organisation (FAO/WHO), 2002). Recently, two novel sulfo-metabolites of DON were reported in wheat (Warth et al., 2015), namely DON-3-sulfate (DON3S) and DON-15-sulfate (DON15S) and the former one was identified also as a human urinary metabolite (Warth et al., unpublished).
Since these compounds could have a similar biological activity as their parent compound DON, their characterisation is of crucial importance in order to evaluate their toxicological relevance. Thus, during this thesis, the biological activity of DON3S and DON15S was investigated in comparison to DON in the human colorectal adenocarcinoma cell line HT-29. For this reason, a panel of assay was selected on the basis of the pre-existing data about the parent compound DON. As a first step, the impact of DON, DON3S and DON15S on the intracellular oxidative stress was investigated through the DCF assay. Both DON (10 µM) and DON3S (1 and 10 µM) increased significantly the ROS levels in a quite fast and transient reaction (3 min). In fact, after two hours of incubation cells recovered to basal level again. DON15S only triggered a slight increase effect after 3 hours of incubation.
In order to verify if the increase of oxidative stress affected cell viability and proliferation, the SRB, the WST-1 assay and a confluence analysis were performed. After 24 hours of incubation, DON showed a biphasic response, inducing cell proliferation at 0,1 µM and resulting in significant cytotoxic effects at concentrations of 10 µM and higher. DON3S and DON15S, on the other hand, showed a significant stimulating effect on cell proliferation at concentrations from 0,1 µM to 25 µM. The induction of cell proliferation and also the cytotoxicity of DON at 10 µM were further confirmed and supported by the results of immunocytochemical quantification of the proliferation marker KI-67 and of cells in mitosis.
Overall, in the experimental system used during this thesis the two sulfo-metabolites did not seem to share the same toxicological activities as their parent compound DON, but still the impact of DON3S and DON15S on the cellular proliferation characterised during this thesis open new possibilities to evaluate the risk associated to the entrance of these compounds into the food and feed chain.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Deoxynivlaneol DON DON-sulfate HT-29 toxicology DON-3-sulfate DON-15-sulfate
Schlagwörter
(Deutsch)
Deoxynivalneol DON DON-Sulfate HT-29 Toxikologie DON-3-Sulfat DON-15-Sulfat
Autor*innen
Lydia Wölflingseder
Haupttitel (Englisch)
The impact of deoxynivalenol (DON) amd its metabolites DON-3-sulfate and DON-15-sulfate on the human colorectal adenocarcinoma cell line HT-29
Paralleltitel (Deutsch)
Der Einfluss von Deoxynivalenol (DON) und seinen Sulfo-Metaboliten DON-3-Sulfat und DON-15-Sulfat auf die humane Koloncarzinomzelllinie HT-29
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
VIII, 136 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Doris Marko
Klassifikationen
35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,
35 Chemie > 35.99 Chemie: Sonstiges
AC Nummer
AC13348284
Utheses ID
37879
Studienkennzahl
UA | 190 | 423 | 350 |