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Towards an understanding of membrane binding properties of MRCK
Elisabeth Fuchs
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Thomas A. Leonard
DOI
10.25365/thesis.42797
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-28694.79306.199554-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
MRCK ist eine AGC-Kinase, die eine wichtige Rolle in der Umstrukturierung des Cytoskelettes und der Zellbewegung spielt. Die carboxy-terminale Region ist für die Wechselwirkung mit anderen Proteinen und der Membran wichtig und beinhaltet eine C1, eine PH, eine CNH-Domäne, und die sogenannte CRIB-Domäne, welche die aktivierte GTPase Cdc42 und mit geringerer Affinität auch Rac1 bindet. Aktuell ist nicht bekannt, wie diese C-terminalen Domänen drei dimensional angeordnet sind, welche möglichen Lipid-Liganden sie haben, und welche Rolle sie in der Membranlokalisierung spielen.
Um die Rolle der C-terminalen Domänen in der Membranlokalisierung zu verstehen versuchten wir die Kristallstruktur der regulatorischen C-terminalen Region aufzuklären, sowie Wechselwirkung zwischen MRCK und Cdc42 zu quantifizieren.
Ein Lipid-Bindeassay ergab, dass 45 % MRCK (C-terminale Region) an Hirn-Lipide binden. Proteinkristalle der C-terminalen Region ohne der CRIB-Domäne lieferten Beugungsdaten, die die Raumgruppe P1 mit sechs Atomen in der Einheitszelle ergaben. Wir erhielten einen nativen Datensatz bis 2.3 Å, aber Versuche, die Struktur durch „Molecular Replacement“ mit homologen Strukturen der C1 und PH Domänen aufzuklären, waren nicht erfolgreich. Die Kristallstruktur der carboxy-terminalen Domäne konnte nicht aufgeklärt werden, aber wir erwarten, die Kristallstruktur mit Hilfe des Selenomethionin-substituierten Proteins und der MAD-Methode lösen zu können.
Experimente zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen MRCK und Cdc42 ergaben keine (oder nur sehr schwache) Bindung. Mit Hilfe der Fluoreszenzanisotropie konnte eine Dissoziationskonstante für Cdc42 und MRCK von 20 μM gemessen werden. Der Versuch, die Bindungskurve mit einem MBP-Cdc42 Fusionsprotein zu verbessern, ergab jedoch keinerlei Bindung, genauso wie Untersuchungen mit Rac1 als Bindungspartner.
Abstract
(Englisch)
MRCK is an AGC kinase that plays a role in the regulation of cytoskeletal reorganization and cell migration. The carboxy-terminus of MRCK is important for the interaction with other proteins and the membrane and it contains a C1, a PH, a CNH, and the CRIB domain, which is said to bind to the activated form of Cdc42 and with a lower affinity to Rac1. To date, there is no information available about the three dimensional arrangement of these C-terminal domains, about its putative lipid ligands, and about their role in membrane targeting.
In order to understand the role of the C-terminal domains in membrane localization we aimed to solve the crystal structure of the regulatory C-terminal region and to quantitate the interaction of MRCK with Cdc42.
A lipid binding assay revealed 45 % binding to lipids. Protein crystals of the C-terminal region excluding the CRIB domain yielded a diffraction data revealing space group P1 with 6 atoms in the unit cell. We obtained a native dataset to 2.3 Å, but attempts to solve the structure by molecular replacement with homologous structures of the C1 and PH domains were unsuccessful. We suppose to be able to solve the structure by MAD at the selenium edge.
Experiments investigating Cdc42 binding to MRCK revealed no (or very low) binding. A fluorescence anisotropy assay revealed an estimated Kd of 20 μM. An attempt to improve the binding curve with an MBP-Cdc42 fusion protein was unsuccessful as well as a fluorescence anisotropy assay with Rac1.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
MRCK AGC kinases membrane binding CNH domain CRIB domain Cdc42 small GTPases
Schlagwörter
(Deutsch)
MRCK AGC-Kinasen Membranbindung CNH-Domäne CRIB-Domäne Cdc42 kleine GTPasen
Autor*innen
Elisabeth Fuchs
Haupttitel (Englisch)
Towards an understanding of membrane binding properties of MRCK
Paralleltitel (Deutsch)
Zum Verständnis der Membran-bindenden Eigenschaften von MRCK
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
52, V Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Thomas A. Leonard
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC13266667
Utheses ID
37885
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |