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VPAC receptors as target for anti-cancer drug delivery
Raphaela Elisabeth Kaisler
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Wilhelm Mosgöller
DOI
10.25365/thesis.505
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30239.79865.889661-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Thema, ob VPAC-Rezeptoren als Schlüssel zur Krebsbekämpfung benützt werden können. Es gibt drei Subtypen von VPAC-Rezeptoren, VPAC1, VPAC2 und PAC1, welche alle zur großen Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) gehören und eine wichtige Rolle in der Zellsignaltransduktion spielen. Die zwei wesentlichsten VPAC-Rezeptor Liganden sind Neuropeptide, wie das Vasoaktive Intestinale Peptide (VIP) und das Hypophysen-Adenlyatzyklase-aktivierendes Polypeptid (PACAP). Diese kleinen Peptide üben ihre Funktion als Wachstumsfaktor in der Neurogenese und Entwicklung aus, stimulieren Hormonausschüttung, vermindern Entzündungen und unterstützen den Tumorwachstum. VIP wirkt auch als Vasodilator und relaxiert glatte Muskulatur. Frühere Studien vieler Arbeitsgruppen haben sich mit VPAC-Rezeptor Tumorerkennung und Diagnostik beschäftigt, wobei viele spezifische Agonisten und Antagonisten wurden dabei entwickelt. VIP ist in vielen Geweben weit verbreitet, wie zum Beispiel im Pankreas, Prostata, Thyroidea, Lunge, Brust, Skelett-und glatte Muskulatur und Gefäßen. Die VPAC Expression in endokrinen Tumorzellen zeigt eine Dominanz des VPAC1 Rezeptors, in Gefäßen und Muskelzellen des VPAC2 Rezeptors. PAC1 ist hauptsächlich im Hirngewebe zu finden.
In dieser Arbeit haben wir uns mit drei Fragestellungen beschäftigt. Der selektive Agonist (Ala11,22,28)-VIP wird für die spezifische VPAC1 Tumorerkennung eingesetzt. Mit diesem System können wir den durch Applikation ausgelösten hypotonen Schock umgehen und schaffen eine im Patienten angewandte spezifische VPAC1 Tumorerkennung ohne Nebenwirkungen. (Ala11,22,28)-VIP verpackt in Liposome oder Proticle ermöglicht die spezifische Eintrittsstelle über den VPAC1 Rezeptor, um Chemotherapeutika oder anti-sense RNS oder andere Pharmakophore einzuschleusen. Das zweite Thema behandelt sich mit dem Einsatz von VIP-DOTA-Gd in der Tumordiagnostik. Ein neuer nicht-radioaktiver Ansatz mit VIP-DOTA-Gd ermöglicht die Anwendung des Peptidkonjugates für Tumorscreens in der Magnetresonanz (MRI). Der dritte Gedanke beschäftigt sich mit einer selektiveren Anwendung von photodynamischer Therapie (PDT) über VPAC-Rezeptoren. Ein VIP-Hematoporphyrin Konjugat erkennt spezifisch VPAC positive Tumore und ermöglicht eine selektive Bestrahlung von erkranken Gewebe.
Am Beginn dieser Arbeit stand die Charakterisierung von 14 humanen Tumorzelllinien verschiedener Organe und einer mikrovaskulären endothelialen Zelllinie, welche mittels Immunozytochemie (ICC) mit spezifischen Antikörpern durchgeführt wurde. In der Zellkultur wurde eine heterogene Expression der VPAC-Rezeptoren gefunden, zB. bei PANC-1 Zellen, deshalb sollte eine Charakterisierung auch in lebenden Tumorgewebe, dass nach der Operation erhalten wird, durchgeführt werden. Die spezifische Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor und die anschließende Internalisierung von VIP-Konjugaten, (Ala11,22,28)-VIP, VIP-DOTA-Gd und VIP-PDT, wurde mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS), Konfokale Laserscan Mikroskopie (CLSM) und cAMP ELISA durchgeführt. VIP eingeschlossen in Liposomen oder Proticle wurden als Beförderungsmittel zur Tumorzelle getestet, da VIP im Blut proteolytisch abgebaut wird und daher eine sehr geringe Halbwertszeit von 1-2 Minuten hat. Dieser Ansatz wurde mit cAMP ELISA nachgewiesen und zeigten Liposome und Protcles eine 20-30 minütige verzögerte cAMP-Ausschüttung gegenüber freiem VIP. Proliferations-und Zytotoxizitätsstudien (MTT-Test) wurden mit allen VIP-Konjugaten durchgeführt. Keines der VIP-Konjugate, VIP, VIP-DOTA-Gd, (Ala11,22,28)-VIP und PACAP zeigte eine zytotoxische Wirkung, manche Zelllinien nützen VIP und Konjugate sogar als Wachstumsfaktor. Das VIP-Hematoporphyrin Konjugat wurde auf seine Potenz als lichtempfindlicher chemischer Stoff, Photosensibilisator, getestet. Als Detektionssystem wurde DCFDA verwendet um die Freisetzung von Sauerstoff-reaktiven Spezies (ROS) durch VIP-PDT nach Bestrahlung nachzuweisen. Behandelte Tumorzellen mit VIP-PDT nach Bestrahlung zeigten keinen Anstieg von Sauerstoff-reaktiven Spezies und keine Reduktion des Zellwachstums. Die Apoptose oder Proliferation der Zellen wurde mit dem MTT-Test ermittelt. Als Kontrolle wurden die Tumorzellen mit einem bekannten Photosenibilisator, Photofrin® (Hematoporphyrin Oligomer), getestet. Ungefähr 20% der Zellen gingen nach Bestrahlung in Apoptose, daraus schließen wir, dass VIP-PDT mit einer einzelnen Hematoporphyrin Gruppe nicht in der Lage ist Sauerstoff-reaktive Spezies in der Zelle zu induzieren. Möglicherweise verhindert ein durch Strahlen ausgelöster Abwehrmechanismus der Zelle eine vermehrte Produktion von Sauerstoff-reaktiven Spezies.
Abschließend möchte ich die Wirksamkeit von (Ala11,22,28)-VIP, einem selektiven VPAC1 Agonisten, hervorheben, welcher zukünftig der Schlüssel zur Einschleusung von Chemotherapeutika oder anderen zellschädigenden Substanzen von VPAC-Rezeptor expremierenden Krebszellen sein könnte. Weiters hat VIP-DOTA-Gd das Potential als nicht-radioaktives Peptidkonjugat VPAC positive Tumore in einem Tumorscan mit MRI zu erkennen. Da wir inhomogene VPAC-Rezeptorexpression in der Zellkultur gezeigt haben, sollten die zukünftigen Arbeiten zu diesem Thema mit postoperativen Lebendtumorgewebe und Mausmodellen durchgeführt werden.
Abstract
(Englisch)
In this work we were interested in the potency of VPAC receptors as target for anti-cancer drug delivery. There are three subtypes of VPAC receptors, VPAC1, VPAC2 and PAC1. They belong to the large superfamily of G-protein coupled receptors (GPCR) which play an important role in cell signalling. The two most major specific VPAC receptor ligands are neuropeptides, vasoactive intestinal peptide (VIP) and pituitary adenlyate cyclase activating polypeptide (PACAP). These small peptides function as trophic factor in neurodevelopment, stimulate hormone release, have anti-inflammatory effects and benefit tumour proliferation. VIP is an important vasodilator and relaxant of smooth muscle cells. Previously VIP´s action for tumour targeting and use in tumour diagnostics has been well studied by many groups. Lot of specific agonists and antagonists have been developed to target VPAC expressing tumour cells. VIP is widely distributed in the most tissue (pancreas, prostate, stomach, thyroid, lung, breast, brain, skeletal and smooth muscles and vessels) and VPAC expression pattern showed that most endocrine tumours express dominantly VPAC1 receptor and vessels and smooth muscles VPAC2, PAC1 is mostly present in the brain.
We investigated three ideas in this work, on the one hand selective tumour targeting with a VPAC1 specific peptide (Ala11,22,28)-VIP, because of the VPAC2 expressing vessels and muscles cells. This receptor pattern helps use to circumvent the hypotonic shock after systemic application and can be used for patients without adverse effects. (Ala11,22,28)-VIP engulfed in liposomes and loaded with anti-sense RNA or other downregulating or destroying drugs could be used as pharmacophor. On the other hand we designed a peptide conjugate, VIP-DOTA-Gd, for non-radioactive tumour targeting for magnet resonance imaging (MRI) diagnosis. At last a VIP-hematoporphyrin conjugate, VIP-PDT, was developed to increase selective photodynamic therapy (PDT) for VPAC expressing cancer cells.
First we characterized 14 human tumour cell lines from different organs and one microvascular endothelial cell line for their VPAC receptor expression pattern performed with immunocytochemistry (ICC) stainings with specific antibodies. Cell culture showed heterogenic expression of VPAC receptors and different expression pattern with cell age (PANC-1), therefore living surgically removed human tumour tissue should be analysed. Specific interaction of ligand and receptor and the following internalisation into the cytoplasm of VIP conjugates, (Ala11,22,28)-VIP, VIP-DOTA-Gd and VIP-PDT, were visualised by fluorescence correlation spectroscopy (FCS), confocal laser scanning microscopy (CLSM) and cAMP ELISA. Also VIP engulfed in liposomes or proticles was tried for delayed VIP release, because VIP is proteolytic cleaved in extracellular fluid and therefore its half life time is about 1-2 min. These assays performed with cAMP ELISA indicated a 20min to 30min delay of cAMP release compared to free VIP. Proliferation properties of VIP-conjugates were obtained with MTT assays and analysed for their cytotoxic behaviour. None of the tested peptides, VIP, VIP-DOTA-Gd, (Ala11,22,28)-VIP and PACAP showed cytotoxic effects, some cell lines used VIP or conjugates as proliferative factor. VIP-hematoporphyrin conjugate was tested for its potential as selective light sensible chemical substance, photo-sensitiser, for PDT. Experiments performed with DCFDA as detection system revealed a release of reactive oxygen species (ROS) after incubation of VIP-PDT treated with radiation. Cells treated with VIP-PDT and radiation did not increase ROS and no reduction of cell growth was observed. As control we used a classical PDT substance, Photofrin® (hematoporphyrin oligomer), which indicated apoptosis of tumour cells of about 20%-50% after treatment with radiation. So we conclude that VIP-PDT with a single hematoporphyrin group is not able to induce enough ROS inside the cell, which might depend on defence mechanisms of the cell.
Finally we can say that the development of a selective VPAC1 tumour targeting system with (Ala11,22,28)-VIP could be useful for anti-cancer drug delivery. Further VIP-DOTA-Gd can be used to target VPAC positive tumours to increase the sensitivity of tumour screenings by MRI. Because we observed inhomogeneous receptor expression in the very same cell line and receptor loss in the in vitro models when cells grow over time future investigations should employ surgically removed human material and mouse models.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
VPAC receptors VIP-conjugtes photodynamic therapy VIP-DOTA-Gd for MRI VPAC1-specific peptide anti-cancer drug delivery
Schlagwörter
(Deutsch)
VPAC Rezeptoren VIP-Konjugate Photodynamische Therapie VIP-DOTA-Gd für MRI VPAC1-spezifisches peptide Pharmakotherapie
Autor*innen
Raphaela Elisabeth Kaisler
Haupttitel (Englisch)
VPAC receptors as target for anti-cancer drug delivery
Paralleltitel (Deutsch)
VPAC Rezeptoren für die gezielte Pharmakotherapie
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
142 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Wilhelm Mosgöller
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC06775668
Utheses ID
381
Studienkennzahl
UA | 490 | | |