Detailansicht

Biomimicry nano- and microparticles

applications for peptide/protein delivery and encapsulation

Manuel Hafner

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (Dissertationsgebiet: Chemie)

Betreuer*in

Christian Friedrich Wilhelm Becker

Volltext herunterladen
Volltext in Browser öffnen

DOI

10.25365/thesis.43189

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-18776.81379.131070-7

Link zu u:search

(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Nanopartikel für biotechnologische sowie medizinische Anwendungen sind in den letzten 20 Jahren zunehmend in den Fokus der Forschung gerückt. Nanopartikel werden für gezielte Wirkstofffreisetzung, Enzymstabilisierung sowie die bildgebende Diagnostik verwendet. In dieser Arbeit untersuchen wir die verschiedenen Einflüsse, welche diese Partikel auf Proteine und Peptide haben, um stabilisierte Partikel-Enzym Konjugate zu produzieren sowie die strukturellen Veränderungen zu verstehen, die Proteine durchführen wenn sie mit Nanopartikeln interagieren. Zusätzlich werden wir dieses Wissen einsetzen um ein etabliertes Verfahren zur Produktion von Silicamikropartikeln mit eingeschlossenen Peptiden zu optimieren und seine Nutzbarkeit für eine gezielte Wirkstofffreisetzung zu zeigen. Aktuelle Immobilisierungsverfahren in der Biotechnologie sind für die meisten Enzyme ungeeignet. Systeme zur Immobilisierung von Enzymen um diese Festphasen wiederholt verwenden zu können sind auf wenige Enzyme beschränkt die durch die Anheftung an solche Systeme keine negativen sterischen Effekte erfahren die sie in ihrer Aktivität einschränken. Ein Beispiel für eine mögliche Lösung dieses Problems findet sich in der Immobilisierung von Zellulase auf Nanopartikeln. Mit diesem System wird pseudo-homogene Katalyse ermöglicht. Immobilisierung des Enzymes auf magnetischen Nanopartikeln erlaubt eine einfache Entfernung des Enzyms aus der Reaktionslösung und somit ein elegantes System zu ihrer Wiederverwendung. Anbindung des Enzyms soll durch ein kleines Ankerpeptid ermöglicht werden, welches eine hohe Affinität für Magnetitoberflächen besitzt. Eine Reihe von Peptiden, welche die Sequenz des Magnetosom Membranproteins Mms6 aus Magnetospirillum Gryphiswaldense abdecken, wurde synthetisiert. Um den besten Kandidaten für ein Enzym-Linker System zu finden wurde die Affinität dieser Peptide zu Magnetit Nanooberflächen untersucht. Vielversprechende Kandidaten aus diesem Pool würden mit einem Zellulase Enzyme gekoppelt und Rekombinant als Testsystem exprimiert. Um die Interaktion zwischen Enzymen und Nanopartikeln besser zu verstehen wurde ein Testsystem mit mehreren Nanopartikeln aus verschiedenen anorganische Materialen (Magnetit und Silica) und unterschiedlichen Größen entworfen. Unter Verwendung von Zellulase als Testenzym wurde ein Proteincorona basiertes Adsorptionssystem verwendet, um Zellulase auf verschiedenen Nanopartikeln zu immobilisieren. Zellulase welche auf diese Weise auf Nanopartikeln adsorbiert erfährt durch die hohe Oberflächenkrümmung der Partikel eine Veränderung der Struktur, was mit einer Veränderung der Aktivität einhergeht. Wie diese Änderung mit dem Material und der Größe der Partikel zusammenhängt, und ob die Änderung von Vorteil oder Nachteil für die Aktivität des Enzymes ist wurde mittels Zirkulardichroismus und verschiedenen Aktivitätsassays untersucht. Zusätzlich zur Adsorption von Enzymen auf Nanopartikeln wurde die Verkapselung von Molekülen in Silicapartikeln mittels einer self-assembly Methode welche die Hüllenformierung der Kieselalge nachahmt untersucht. Unter Verwendung von R5-Cys, ein synthetisches Peptid welches auf dem Silaffin Protein der Kieselalge basiert ist es möglich Silicapartikel aus neutraler Lösung zu präzipitieren und das R5-Cys Peptid dabei im Partikel einzuhüllen. Kovalente Anbindung des Wirkstoffs an das Peptid führt damit zu einem Einschluss des Wirkstoffs in die Partikel ohne komplexe Chemie unter voller Kontrolle der Aufnahme. In dieser Arbeit nutzten wir fluoreszenzmarkierte Partikel um die Internalisierung in HT-29 Darmkrebszellen zu zeigen, und einen gezielten Wirkstofftransport zeigen zu können.

Abstract

(Englisch)

Nanoparticles for medical as well as biotechnological purposes have gathered an increasing amount of attention over the last 20 years. Nanoparticles are used for a multitude of applications such as drug delivery, enzyme stabilization and imaging. In this work we look at different variants of particle-peptide or -protein interaction to generate stabilized particle enzyme conjugates and understand the structural changes proteins undergo when interacting directly with nanoparticle surfaces. Current biotechnological immobilization techniques are not suitable for most enzymes. Immobilization of enzymes on solid, removable supports often hampers the enzymes activity due to steric hindrances or negative effects on enzyme structure. We evaluated magnetic nanoparticles as a solid support for cellulase immobilization. Cellulase attached to nanoparticles would allow for pseudo-homogeneous catalysis while the magnetic properties of the nanoparticle material will provide an elegant possibility to remove the enzyme from the reaction. Attachment of the enzyme to the nanoparticle would be done by a small peptide with high affinity to magnetite nanoparticle surfaces. A number of peptides, covering the sequence of the magnetosome protein Mms6 found in the bacterium magnetospirillum gryphiswaldense was synthesized. Affinity of the peptides towards magnetite particles was tested in order to find the most promising candidate for an enzyme linker system. In addition to that attempts to produce recombinant variants of linker-cellulase conjugates were made. In order to further the understanding of enzyme – nanoparticle interactions we designed a test system using cellulase and inorganic nanoparticles (magnetite and silica) of different sizes. Cellulase was directly adsorbed on the particles using a non-covalent method based on the protein corona effect. The protein corona effect describes the near irreversible adsorption of proteins and lipids to nanostructures. Cellulase adsorbing on nanoparticles is changed structurally resulting in a change of activity depending on nanoparticle material and size. Adsorbed cellulase interacts with free cellulase via protein-protein interactions, changing the free enzymes structure and activity. The extent of changes to cellulase structure and activity after adsorption on or interaction with nanoparticles is evaluated using several activity assays for different aspects of cellulase activity as well as circular dichroism to observe structural changes in the enzyme. In addition to enzymatic adsorption on nanoparticles, the encapsulation of sample molecules in silica particles via a self-assembly method mimicking the shell formation of diatoms was evaluated. Using a silaffin derived synthetic peptide, R5-Cys, it is possible to precipitate silica microparticles from neutral solutions at room temperature and entrap the peptide within providing an elegant method to load particles with molecules at mild conditions in a controlled manner. Here we designed fluorescent labeled variants of the R5-Cys peptide to test internalization and release of R5-Cys in HT-29 colon cancer cells.

Autor*innen

Manuel Hafner

Haupttitel (Englisch)

Biomimicry nano- and microparticles

Hauptuntertitel (Englisch)

applications for peptide/protein delivery and encapsulation

Paralleltitel (Deutsch)

Biomimetische Nano- und Mikropartikel: Anwendungen für Peptid/Protein Wirkstofftransport und Verkapselung

Publikationsjahr

2016

Umfangsangabe

vii, 81 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Christopher Gerner ,

Thomas Brück

Klassifikationen

35 Chemie > 35.76 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße ,

35 Chemie > 35.79 Biochemie: Sonstiges

AC Nummer

AC13435839

Utheses ID

38225

Studienkennzahl

UA | 796 | 605 | 419 |

Detailansicht

Abstracts

Schlagwörter