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Plectin's role in cytoskeletal remodelling in endothelial cells
Daniela Halak
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Gerhard Wiche
DOI
10.25365/thesis.507
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29404.68577.908562-5
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Plectin ist ein außergewöhnlich großes Protein mit vielen Bindungsdomänen, welches die Cytoskelettfilamentsysteme miteinander verbindet. Weiters stellt Plectin eine Plattform für Signalmoleküle dar. Im Zuge dieser Diplomarbeit wurde die Rolle von Plectin in Endothelzellen näher betrachtet.
Zwei unterschiedliche Endothelzelllinien wurden für die durchgeführten Experimente verwendet. Nieren- und Lungenzellen von wildtyp Plectin+/+ und knock-out Plectin-/- Mäusen wurden mittels Polyoma middle T Infektion immortalisiert. Das middle T Antigen verursacht Zellproliferation und bewirkt einen Wachtstumsvorteil von Endothelzellen gegenüber anderen Zelltypen (Williams et al., 1988). Eine genaue Charakterisierung dieser Zelllinien ergab, dass Endothelzell-spezifische Markerproteine in Plectin+/+ und Plectin-/- Zellen exprimiert werden, jedoch wurden reduzierte Mengen von eNOS, Caveolin und VE-Cadherin in Plectin-/- Zellen gefunden. Zellfraktionierungen zeigten, dass Caveolin, eNOS und VE-Cadherin in Plectin-/- Zellen in der Membranfraktion angehäuft sind, während sie in der Cytoskelettfraktion reduziert sind.
Messungen von extrazellulärem Stickstoffoxid (NO) zeigten, dass Plectin-/- Endothelzellen weniger NO produzieren als Plectin+/+ Zellen. Weiters, wurden in Plectin-/- Zellen reduzierte Mengen von Gesamt-eNOS und eine verringerte Aktivität von eNOS nachgewiesen.
Mechanische Reize, wie vom Blutfluss oder Blutdruck verursachte Scher-kräfte, beeinflussen die Funktionen von Endothelzellen durch das Aktivieren von Mechanosensoren an der Zellmembran. Diese Mechanosensoren wieder-um aktivieren verschiedene Signalwege, welche die Aktivierung und die Ex-pression verschiedener Proteine beeinflussen (Chien, 2006). Plectin+/+ und Plectin-/- Zellen wurden Scherkräften ausgesetzt und durch Immunofluores-zenzmikroskopie und Immunoblots analysiert. Eine erhöhte Expression von eNOS und Caveolin wurde als Antwort auf Schwerkräfte in Plectin+/+ und Plectin-/- Zellen festgestellt, jedoch in geringerem Maße in Plectin-/- Zellen. Des Weiteren, war die Scherkraft-induzierte VE-Cadherin Clusterbildung in Plectin-/- im Vergleich zu Plectin+/+ Zellen stark reduziert.
Diese Daten weisen darauf hin, dass Plectin, durch die Regulation von En-dothelzell-spezifischen Molekülen, wie eNOS und VE-Cadherin eine wichtige Rolle in Endothelzellen spielt. Weiters, wurde eine eventuelle Beteiligung von Plectin an der Erkennung und / oder an der Antwort auf Scherkräfte in Endo-thelzellen beobachtet.
Abstract
(Englisch)
Plectin, a multi-domain protein of extraordinary large size, is known to connect cytoskeletal filament systems. Furthermore, plectin is supposed to be a scaffolding platform for signalling molecules. In this thesis plectin’s eventual role in regulating endothelial cell (EC) function was investigated.
Two different endothelial cell lines were used for analysis. Briefly, cells de-rived from kidneys and lungs of plectin+/+ and plectin-/- mice were immortalized by polyoma middle T infection. The middle T antigene causes cell proliferation and specifically ECs gain proliferation advantage over other cells (Williams et al., 1988). Thorough characterization of these cell lines revealed that EC markers are expressed in both plectin+/+ and plectin-/- ECs, although the total amounts of eNOS, caveolin and VE-cadherin are reduced in plectin-/- ECs. Data obtained from cell fractionation experiments showed that caveolin, eNOS and VE-cadherin are increased in membrane fractions of plectin-/- cells com-pared plectin+/+ ECs at the expense of the cytoskeleton fractions.
Measurement of extracellular nitric oxide (NO) demonstrated that plectin-/- ECs produce less NO compared to plectin+/+ ECs. Moreover, plectin-/- cells show reduced levels of total eNOS and reduced activity of eNOS.
Mechanical stimuli like shear stress resulting from blood pressure and flow modulate functions of ECs by activating mechanosensors on the cell mem-brane. These in turn activate different signalling pathways modulating the activation state and the expression of different proteins (Chien, 2006). Shear- stressed plectin+/+ and plectin-/- ECs were analysed by immunofluorescence microscopy and immunoblotting. In response to fluid shear stress an upregulation of eNOS and caveolin was observed in both plectin+/+ and plectin-/- ECs, although to a lesser extent in plectin-/- cells. Furthermore, shear stress-induced VE-cadherin cluster formation was significantly reduced in plectin-/- compared to plectin+/+ ECs. Based on these data, it is suggested that in ECs plectin plays a major role as a regulator of EC key molecules like eNOS and VE-cadherin. Furthermore, an eventual involvement of plectin in sensing and / or responding to fluid shear stress was observed.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Plectin endothelial cells characterization of 2 cell lines cell fractionation NO measurment shear stress experiments
Schlagwörter
(Deutsch)
Plectin Endothelzellen Charakterisierung von 2 Zelllinien Zellfraktionierung NO Messungen Scherkraft Experimente
Autor*innen
Daniela Halak
Haupttitel (Englisch)
Plectin's role in cytoskeletal remodelling in endothelial cells
Paralleltitel (Deutsch)
Die Rolle von Plectin bei Veränderungen des Cytoskeletts in Endothelzellen
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
92 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Gerhard Wiche
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC06775811
Utheses ID
383
Studienkennzahl
UA | 490 | | |