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Structural and functional studies on the regulation of the protease-chaperone function of DegP and DegQ from Escherichia coli

Justyna Zofia Sawa-Makarska

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Tim Clausen

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DOI

10.25365/thesis.509

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29955.09263.966463-0

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die fehlerhafte Entfernung von ungefalteten Proteinen kann zur Bildung von möglicherweise gefährlichen Aggregaten, zur Inaktivierung von funktionellen Proteinen bis hin zum Tod einer Zelle führen. Um eine einwandfreie Homöostase aufrechtzuerhalten hat die Zelle ein System zur Überwachung der Proteinqualität entwickelt. Dieses Kontrollsystem umfasst spezielle Chaperone und Proteasen, die den Zustand von zellulären Proteinen unter physiologischen und unter Stressbedingungen überwachen. Abhängig vom Grad der Beschädigung der nicht-nativen Proteine werden diese entweder rückgefaltet oder aber entfernt. In Escherichia coli wird der Zustand von periplasmatischen Proteinen von zwei Repräsentanten der HtrA Proteasefamilie überwacht: DegP und DegQ. Das Hitzeschockprotein DegP verfügt über eine abbauende und eine rückfaltende Aktivität und es kann zwischen diesen beiden gegensätzlichen Funktionen in regulierter Weise umschalten. In dieser Arbeit wurden verschiedene DegP/Substrat-Komplexe charakterisiert. Es zeigte sich, dass fehlgefaltete Proteine das hexamere DegP in große, katalytisch aktive 12- und 24-mere Partikel umwandeln, abhängig von der Größe und der Konzentration des vorliegenden Substrates. Die gleiche Art der Regulation, d.h. eine Aktivierung der Proteaseaktivität durch eine substratinduzierte Umwandlung des Oligomers, konnte auch für DegQ festgestellt werden. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass dieser einzigartige Regulationsmechanismus ein konserviertes Merkmal der HtrA Familie darstellt. Weiterhin zeigte die strukturelle und biochemische Analyse von DegP im Komplex mit Außenmembranproteinen (outer membrane proteins, OMPs), dass DegP Proteine in einer zentralen Kammer einschließt, die sowohl als Chaperon als auch Protease-Kompartiment dienen kann. Während die Einkapselung von gefalteten OMP Protomeren schützend wirkt und möglicherweise den sicheren Transport durch das Periplasma gewährleistet, werden fehlgefaltete Proteine in der molekularen Reaktionskammer abgebaut. Um weitere typische Merkmale der HtrA Familie zu bestimmen, konzentrierte sich diese Studie darauf, regulatorische und mechanistische Unterschiede zwischen den beiden eng verwandten Protease-Chaperon Systemen, DegP und DegQ zu ermitteln. Untersuchungen der Proteaseaktivität und des Molekulargewichtes des DegQ Oligomers mittels Gelpermeationschromatografie ergaben, dass niedrige pH-Werte (5.5) eine Umwandlung von DegQ von einem hexameren zu einem möglicherweise dodekameren Zustand induzieren. Auffälligerweise war die Veränderung des oligomeren Zustandes mit einer Veränderung der Proteaseaktivität verbunden, die im Gegensatz zu DegP, am höchsten bei niedrigen pH-Werten war. Bei der weitergehenden Untersuchung der in vivo Relevanz dieser Beobachtung zeigte sich, dass DegQ vor allem für das Wachstum von Escherichia coli bei niedrigen pH-Werten wichtig ist. Dies deutet darauf hin, dass die pH-abhängige Regulation von DegQ die Adaption des Bakteriums an eine Umgebung mit veränderbarem pH-Wert wiederspiegelt. Weiterhin zeigte das Wachstum eines degQ null Stammes eine verlängerte Adaptionsphase im Vergleich zum Wildtyp, was auf eine grundlegende Rolle von DegQ in der Proteinhomöostase hinweist, welche essentiell in der äußerst instabilen Umgebung der bakteriellen Zellhülle ist.

Abstract

(Englisch)

The failure to eliminate misfolded proteins can cause the formation of potentially toxic aggregates, inactivation of functional proteins and ultimately cell death. In order to sustain proper homeostasis cells have developed a system of protein quality surveillance. It involves dedicated chaperones and proteases to monitor and control the state of cellular proteins and depending on the degree of damage, either refold or digest aberrant proteins. The pool of periplasmic proteins of E .coli is quality-controlled by two representatives of the HtrA proteases family, namely DegP and DegQ. The heat-shock protein DegP combines digestive and remodelling activities and can switch between these antagonistic functions in a tightly regulated manner. In this study the characterization of different DegP/substrate complexes revealed that binding of misfolded proteins transformed hexameric DegP into large, catalytically active 12- and 24-meric multimers dependent on the size and concentration of the substrate. The same mode of regulation, i.e. protease activation by substrate-induced oligomer reassembly, also appears in DegQ indicating that this unique regulatory mechanism is a conserved feature of HtrA proteins. Moreover, structural and biochemical analysis of DegP complexes with outer membrane proteins (OMPs) revealed that DegP represents a protein packaging device whose central compartment serves antagonistic functions. While encapsulation of folded OMP protomers is protective and might allow safe transit through the periplasm, misfolded proteins are eliminated in the molecular reaction chamber. In parallel to elucidate common HtrA features, this study focused on regulatory and mechanistic differences between the two closely related protease-chaperones DegP and DegQ. Activity assays and size exclusion chromatography analysis demonstrated that low pH (5.5) induces remodeling of the DegQ particle, most likely from hexamer to dodecamer. Remarkably, the conversion of the oligomeric state was accompanied by a change in the protease activity being, in contrast to DegP, the most pronounced at low pH. In vivo DegQ was shown to affect the growth of E. coli at lower pH values, while the presence of DegP had no effect. Thus the pH dependent activity of DegQ might reflect adaptation of the bacterium to habitats with variable pH values. Furthermore, the growth of degQ null mutant strain shows an elongated adaptation phase compared to the wild type, indicating an important house keeping function of DegQ, which is essential in the highly unstable environment of the bacterial envelope.

Autor*innen

Justyna Zofia Sawa-Makarska

Haupttitel (Englisch)

Structural and functional studies on the regulation of the protease-chaperone function of DegP and DegQ from Escherichia coli

Paralleltitel (Deutsch)

Strukturelle und funktionelle Untersuchungen über die Regulation der Protease-Chaperon Funktion von DegP und DegQ aus Escherichia coli

Paralleltitel (Englisch)

Structural and functional studies on the regulation of the protease-chaperone function of DegP and DegQ from Escherichia coli

Publikationsjahr

2008

Umfangsangabe

132 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Kristina Djinovic-Carugo ,

Iwona Adamska

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC05037139

Utheses ID

385

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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Schlagwörter