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Molecular dissection of flavivirus membrane fusion by structure-based mutational analysis
Richard Fritz
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Franz Xaver Heinz
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30219.05948.207459-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Flaviviren sind kleine membran-umhüllte RNA Viren, die in vielen Fällen durch Stechmücken oder Zecken auf ihre Vertebratenwirte übertragen werden. Die wichtigsten humanpathogenen Vertreter sind das Frühsommer-Meningo-Enzephalitis (FSME) Virus, das Gelbfieber Virus, das West Nil Virus, das Japanische Encephalitis Virus und die Dengue Viren. Die Infektion einer Wirtszelle durch umhüllte Viren erfordert die Verschmelzung (Fusion) der viralen mit einer zellulären Membran um die genetische Information der Viren in das Zellzytoplasma freizusetzen. Im Fall der Flaviviren erfolgt diese Membranfusion mit einer endosomalen Membran – nach Aufnahme durch Rezeptor-vermittelte Endozytose – und wird durch den sauren pH-Wert im Endosom ausgelöst. Dieser Prozess wird durch das virale Oberflächenglykoprotein E – ein Klasse II Fusionsprotein – gesteuert, das auf der Oberfläche infektiöser Viren als metastabiles, dimeres Molekül vorliegt. Saurer pH löst in diesem Protein dramatische Änderungen der Konformation und Oligomerstruktur aus, die die beiden Membranen in Kontakt bringen und schließlich zu ihrer Fusionierung führen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass hochkonservierte Histidine in E als molekulare pH Sensoren fungieren und durch ihre Protonierung die Fusions-relevanten Konformationsänderungen auslösen.
Im Hauptteil dieser Dissertation wurden die fünf bei allen Flaviviren konservierten Histidine des E Proteins in rekombinanten Virus-ähnlichen Partikel (RSPs) des FSME Virus mutiert und die Auswirkungen der Substitutionen auf die verschiedenen Schritte des Fusionsprozesses analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass einem Histidin (H323) an der Grenzfläche zwischen zwei Domänen von E eine zentrale und essentielle Rolle als pH Sensor zur Fusionsauslösung zukommt, während Histidine ausserhalb dieser Region keine Rolle bei der Initiierung der Membranfusion spielen.
Weitere Experimente waren der Aufklärung der Rolle des Membranankers des E Proteins im Fusionsmechanismus gewidmet. Im Gegensatz zu allen anderen bekannte viralen Fusionsproteinen, ist das Flavivirus E Protein nicht nur über eine, sondern über zwei transmembranale Helices (TM1 und TM2) in der Virusmembran verankert. Die Deletion von TM2 hatte zwar keinen Einfluss auf die Initiation und die frühen Phasen der Fusion, aber der Prozess wurde in einem intermediären Stadium blockiert und es kam nicht zur Bildung einer Fusionspore. Die experimentellen Befunde weisen darauf hin, dass dieser Effekt auf einen Stabilitätsverlust des in späten Stadien der Fusion gebildeten E Trimeren zurückzuführen ist.
Die genaue Kenntnis der einzelnen Schritte des Fusionsmechanismus kann einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung antiviraler Agenzien leisten, wie das Beispiel des AIDS Erregers HIV zeigt, gegen den bereits ein fusionshemmendes Medikament zur Verfügung steht.
Abstract
(Englisch)
Flaviviruses are small, enveloped RNA viruses. Most of them are transmitted to their vertebrate hosts by mosquitoes or ticks. The most important human pathogenic flaviviruses are tick-borne encephalitis (TBE), yellow fever, West Nile, Japanese encephalitis, and dengue viruses. Infection of a host cell by any enveloped virus requires the fusion of the viral membrane with a cellular membrane to release the viral genome into the host cell’s cytoplasm. Flavivirus fusion occurs at endosomal membranes – following uptake via receptor-mediated endocytosis – and is triggered by the acidic pH in the endosomes. This fusion process is mediated by the major envelope glycoprotein E – a class II viral fusion protein – that exists in a metastable, dimeric conformation at the surface of infectious virions. Acidic pH triggers dramatic rearrangements of the conformation and oligomeric structure of E that bring the two membranes in close proximity and finally result in their fusion. It has been hypothesized that conserved histidines in E function as molecular pH sensors and, by their protonation, initiate the fusion-relevant conformational changes.
In this thesis, the five histidines of E that are conserved among all flaviviruses were mutated in recombinant subviral particles (RSPs) of TBE virus and the effects of these substitutions on the various stages of the fusion process were analyzed. The results showed that one histidine (H323), located at the interface of two domains of E, has a critical and essential role as pH sensor for triggering fusion, whereas conserved histidines located outside this interface were found to be completely dispensable for the initiation of membrane fusion.
Further experimental work aimed at dissecting the functional role of the membrane-anchor of E in the fusion process. The flavivirus E protein is anchored in the viral membrane via two transmembrane helices (TM1 and TM2). This is in contrast to all other known viral fusion proteins that have only single transmembrane domains. The deletion of TM2 of E in TBE virus RSPs had no effect on initiation or the early steps of fusion, but the process was blocked at an intermediate stage, preventing the formation of a fusion pore. The experimental data indicates that this effect is due to a loss of stability of the E trimers formed at late stages of fusion.
The understanding of the details of the fusion process can contribute to the development of antiviral strategies, with one fusion inhibitor directed against HIV now a licensed drug.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
flaviviruses TBE Membrane fusion E-protein histidines membrane anchor
Schlagwörter
(Deutsch)
Flaviviren FSME Membranfusion E-Protein Histidine Membrananker
Autor*innen
Richard Fritz
Haupttitel (Englisch)
Molecular dissection of flavivirus membrane fusion by structure-based mutational analysis
Paralleltitel (Deutsch)
Molekulare Aufklärung der Flavivirus Membranfusion durch Struktur basierte Mutagenese
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
144 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Hans Dieter Klenk ,
Egon Marth
AC Nummer
AC05039906
Utheses ID
3859
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |