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Hunting for co-factors of endosomal toll-like receptors
Irene Aspalter
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Christoph Baumann
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29927.58340.646566-5
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind transmembran Proteine, welche für die Erkennung von Pathogen assoziierten molekularer Strukturen (PAMPs) in der angeborenen Immunität wichtig sind. Zehn strukturell sehr ähnliche TLRs wurden bis jetzt entdeckt, welche entweder in der Plasmamembran (TLR2, -4, -5, -6 und -11) oder in der Membran von Endosomen (TLR3, -7, -8 und -9) lokalisiert sind. Durch Ligandenbindung können TLRs eine intrazelluläre Signalkaskade induzieren, wodurch die Expression von Zytokine, Interferone und Proteine zur Verteidigung der Zelle und des Organismus angeschaltet wird. Obwohl die zehn TLRs strukturell stark konserviert sind, kann ein breites Spektrum an strukturell sehr unterschiedlichen Liganden gebunden werden. Die Komplexität der Bindung zwischen TLRs und PAMPs ist am besten bekannt für die Bindung von Lipopolysaccharid (LPS) durch TLR4, welche drei Cofaktoren benötigt. Die zentrale Hypothese meiner Diplomarbeit geht davon aus, dass TLRs nicht alleine an ihre Liganden binden, sondern verschiede Co-Faktoren benötigen und in Komplexe eingebunden sind, wie es für TLR4 der Fall ist. Um Rezeptor assoziierte Co-Faktoren zu identifizieren wurde systematisch nach endosomalen TLR Komplexen, die für eine angeborene Immunantwort nach viraler Infektion notwendig sind, gesucht. Eine interdisziplinäre Strategie welche Biochemie, Zellbiologie, Bioinformatik und Proteomik umfasst, wurde angewendet. Die murinen, endosomalen TLRs (3, 7, 8 und 9) wurden am C-Terminus mit einer GS-Tandem Affinity-Purification (TAP) Kassette versehen. Diese Konstrukte wurden verwendet, um stabile RAW264.7 Makrophagen Zelllinien, mittels retroviralem Gen-Transfers, zu erzeugen. Um die richtige Prozessierung und Lokalisierung der rekombinanten Proteine zu überprüfen, wurde ein Glycosylierungszustand der vier Rezeptoren überprüft. Die Lysate der stabilen RAW264.7 Zell-Linien wurden für Tandem-Affinity-Purification verwendet, wobei spezielle Bedingungen für endosomale Transmembranproteine angewendet wurden. Anschließend wurden die aufgereinigten Eluate im Massenspektrometer analysiert. Nach bioinformatischer Analyse, basierend auf der CeMM-pulldown Datenbank und Peptidanreicherung, wurde eine Liste von sieben Kandidaten erstellt. Um zu überprüfen, ob diese sieben Kandidaten tatsächlich mit den endosomalen TLRs interagieren wurde Co-Immunprezipitation angewendet, wobei die Interaktion von zwei Kandidaten mit TLRs gezeigt werden konnte. Des Weiteren wurden funktionelle Analysen für diese beiden Kandidaten durchgeführt, um Aufschluss über deren Funktion in der angeborenen Immunität zu erhalten. Diese Arbeit soll dazu dienen das Verständnis von Toll-like Rezeptor vermittelter Pathogen Erkennung und der darauffolgenden Immunantwort zu erhöhen.
Abstract
(Englisch)
Toll-like receptors (TLRs) are trans-membrane proteins that mediate the recognition of pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in innate immunity. Ten structurally highly related TLRs have been identified in mammals, which are either located at the plasma membrane (TLR2, -4, -5, -6 and -11 in mouse) or in the membrane of the endosome (TLR3, -7, -8 and -9). Upon ligand binding, TLRs induce an intracellular signaling cascade to activate transcription factors which initiate the expression of cytokines, interferons and host defense proteins. Notably, a variety of very dissimilar ligands (PAMPs) has been assigned to the structurally highly related TLRs. The complexity of the interface between PAMP and TLR is best understood for the recognition of lipopolysaccharide (LPS) by TLR4. So far, three TLR co-factors have been identified, which are required for the recognition of LPS by TLR4. The central hypothesis of my thesis postulates that TLRs generally function in protein complexes to mediate ligand binding. To identify receptor associated co-receptors and co-factors that are required for the innate immune response to viral infection we started to systematically search for endosomal Toll-like receptor complexes. To achieve this goal, we employed an interdisciplinary strategy combining biochemistry, cell biology, bioinformatics and proteomics. The full length murine, endosomal TLRs (3, 7, 8, 9) have been C-terminally tagged with the GS- tandem affinity purification (TAP) cassette. Signaling competent RAW264.7 macrophages have been virally transduced to generate stable TLR exspressing cell-lines. To assess the proper processing of the TLR-TAP fusion-proteins we analyzed the glycosylation state of the TLR constructs. Tandem affinity purifications of RAW264.7 cell lysates containing the different TLR-fusion proteins were performed using special conditions for endosomal transmembrane proteins. Following the identification of co-purified proteins by mass-spectrometry, a bioinformatics approach, based on the CeMM pull down database, as well as in depth analysis of the literature, seven candidates have been selected. To validate the interactions of the seven selected candidates with endosomal TLRs, co-immunoprecipitation of the human orthologs were performed using transiently transfected HEK293T cells. This allowed the verification of two candidate-TLR interactions. Functional assays, using cell biological, biochemical and immunological methods, were performed to gain insight into the function of those two candidates in innate immunity signaling. This project helps to broaden our understanding of toll-like receptor mediated recognition of viral pathogens by the innate immune system.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
macrophages toll-like receptors endosome tandem-affinity-purification proteomics innate immunity pathogen pattern recognition receptor
Schlagwörter
(Deutsch)
Makrophagen Toll-like Rezeptoren Endosom Tandem-Affinity-Purification Proteomik Angeborene Immunität Pathogen
Autor*innen
Irene Aspalter
Haupttitel (Englisch)
Hunting for co-factors of endosomal toll-like receptors
Paralleltitel (Deutsch)
Identifizierung von Co-Faktoren für endosomale Toll-like Rezeptoren
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
110 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christoph Baumann
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.32 Virologie ,
44 Medizin > 44.45 Immunologie
AC Nummer
AC08105738
Utheses ID
3862
Studienkennzahl
UA | 490 | | |
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