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DNA-based identification of selected medicinal plants and detection of adulterations and admixtures

Corinna Schmiderer

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Dr.-Studium der Naturwissenschaften Botanik (Stzw)

Betreuer*in

Johannes Novak

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DOI

10.25365/thesis.43718

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-21424.33910.853464-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die DNS-basierte Identifizierung von Arzneipflanzen ist besonders bei Proben, bei denen morphologische oder phytochemische Methoden an ihre Grenzen stoßen und eine Artbestimmung nicht möglich ist, eine wertvolle Möglichkeit der Qualitätskontrolle. Für diese Dissertation wurden drei verschiedene Aspekte der DNS-basierten Artidentifikation untersucht: 1) Da es für Routineanalysen eine Arbeitsvereinfachung wäre, wenn möglichst viele Arbeitsschritte vereinheitlicht werden könnten, wurde die Auswirkung unterschiedlicher DNS-Extraktionsmethoden auf den PCR-Erfolg untersucht. Dafür wurde DNS mit fünf Methoden aus verschiedenen Drogenmatrices (wie Wurzeln, Blätter, Blüten und Rinden) extrahiert und mittels PCR analysiert. Der Vergleich der Ergebnisse zeigte jdoch, dass verschiedene Proben unterschiedlich behandelt werden müssen um optimale Erfolge zu erzielen (Schmiderer et al., 2013). 2) Die Verwendung der PCR gefolgt von einer Hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (high-resolution melting curve analysis, HRM) zeigte sich als nützliche Methode für die DNS-basierte Artidentifizierung von Pflanzenproben. Für ausgewählte Zielarten (Helleborus niger, Ranunculaceae [Schmiderer et al., 2010; Mader et al., 2011]; Calendula officinalis, Asteraceae [Schmiderer et al., 2015a]; Peucedanum ostruthium, Apiaceae [Schmiderer et al., 2015b]; Valeriana officinalis, Valerianaceae [Ruzicka et al., 2016]) wurden PCR-Primer mit folgenden Eigenschaften bzw. Zielen entwickelt: 1) Die Primer flankieren die für die Zielart spezifische Mutation. 2) Die in den Amplikons enthaltenen Mutationen verursachen gut unterscheidbare HRM-Kurven. 3) Proben von anderen Arten der Gattung oder nahe verwandten Gattungen können ungefähr gleich gut amplifiziert werden wie die Zielart. Für die Detektion nicht verwandter Pflanzenarten (z.B. Aconitum napellus oder Veratrum album als mögliche Verunreinigungen von Peucedanum ostruthium) wurden eigene Primer entwickelt und mit jenen der Zielarten in einer Multiplex-PCR/HRM verwendet. Die entwickelten Methoden erlaubten sowohl die Authentifizierung der untersuchten Zielarten als auch die Detektion von Verunreinigungen. Das Multiplexen von Primerpaaren ermöglichte die Detektion von Verun¬reinigungen bis zu einem Anteil von nur 0,001% (z.B. Aconitum oder Veratrum in Peucedanum). 3) Um unbekannte pilzliche oder pflanzliche Verunreinigungen in zwei ‚Salviae officinalis folium‘ Handelsproben nachweisen zu können, wurden diese mit einem ‚DNA Metabarcoding‘ Ansatz untersucht (Lukas et al., eingereicht). Dieser Ansatz beinhaltete die separate Amplifikation beider Internal Transcribed Spacers mithilfe von Standard-PCRs, gefolgt von einer Illumina Sequenzierung der PCR-Produkte. Die erhaltenen Sequenzen bewiesen Verunreinigungen der Salbeiproben mit etlichen Arten verschiedenster Pflanzen und Pilze. Die ungleichen Ergebnisse beider Proben von jeweils ITS1 und ITS2 zeigten, dass die qualitative und quantitative Zusammensetzung der erhaltenen Sequenzen von den verwendeten Primern abhängig ist. Abgesehen von den Arten, die mit den verwendeten Primern nicht amplifiziert werden konnten, konnten von den Metabarcoding-Ergebnissen nur Aussagen über die Artenzusammensetzung der Proben gemacht werden, nicht aber über deren mengenmäßige Anteile.

Abstract

(Englisch)

The DNA-based identification of plant material is a valuable tool for quality control, especially in samples, where morphological or phytochemical methods reach their limits and are not able to assign the plant material to species level. For this thesis three areas of the DNA-based identification were investigated: 1) For the application as routine testing methods, it would be simplifying the whole analysis process to standardise as many working steps as possible. Hence five DNA extraction methods followed by subsequent PCR were compared using different plant materials (like roots, leaves, flowers and barks). But the analysis showed that different sample matrices need to be treated differently to obtain optimal results (Schmiderer et al., 2013). 2) The use of polymerase chain reaction (PCR) followed by high-resolution melting curve analysis (HRM) was proven to be a suitable method for the DNA-based identification of plant specimens. For selected medicinal plant species (Helleborus niger, Ranunculaceae [Schmiderer et al., 2010; Mader et al., 2011]; Calendula officinalis, Asteraceae [Schmiderer et al., 2015a]; Peucedanum ostruthium, Apiaceae [Schmiderer et al., 2015b]; Valeriana officinalis; Valerianaceae [Ruzicka et al., 2016]) and their reported adulterants HRM-suitable PCR primers were designed in such a way that 1) primers were flanking species specific mutations (for the target species), 2) those mutations resulted in well distinguishable HRM curves and 3) other species of the genus or closely related genera were amplified approximately equally well with the same primers. For the detection of unrelated species (e.g. Aconitum napellus or Veratrum album as possible adulterants of Peucedanum ostruthium), adulterant-specific primer pairs were designed and multiplexed with the target species-specific primers. The developed approaches allowed both, the authentication of the analysed target species and the detection of adulterants. Multiplexing of different primer pairs allowed the detection of adulterants down to the proportion of 0.001% (e.g. Aconitum or Veratrum in Peucedanum). 3) In order to detect unknown herbal or fungal adulterations two ‘Salviae officinalis folium’ trade samples were analysed by DNA metabarcoding (Lukas et al., submitted). The metabarcoding approach included the separate PCR amplification of both internal transcribed spacers with general primers followed by Illumina sequencing. The obtained sequences revealed the presence of several adulterants belonging to diverse plant families or fungi genera. The unequal results of ITS1 and ITS2 demonstrated that the qualitative and quantitative composition of the obtained sequences is influenced by the applied primers. Apart from species, which were not at all amplified with the used primers, the metabarcoding results were only of qualitative nature.

Autor*innen

Corinna Schmiderer

Haupttitel (Englisch)

DNA-based identification of selected medicinal plants and detection of adulterations and admixtures

Paralleltitel (Deutsch)

DNS-basierte Identifikation von ausgewählten Medizinalpflanzen und Detektion von Verunreinigungen und Beimischungen

Publikationsjahr

2016

Umfangsangabe

108 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Adrian Slater ,

I. A. Khan

Klassifikationen

42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.59 Botanik: Sonstiges

AC Nummer

AC13359320

Utheses ID

38702

Studienkennzahl

UA | 091 | 438 | |

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