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The influence of the -1639 G>A promoter variant on the expression of the vitamin K epoxide reductase gene in HepG2 cells

Cornelia Patry

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Christine Mannhalter

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DOI

10.25365/thesis.4389

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29677.69990.589970-8

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Vitamin K Epoxid Reduktase Komplex Untereinheit 1 (VKORC1) regeneriert im Vitamin K Zyklus Vitamin K Epoxid zu reduziertem Vitamin K. Die reduzierte Form von Vitamin K wirkt als Kofaktor bei der Gamma-Carboxylierung der Vitamin K abhängigen Proteine. Diese Proteine werden erst durch die Gamma-Carboxylierung in ihre aktive Form übergeführt. VKORC1 ist dabei der limitierende Faktor der Regenerationsrate von reduziertem Vitamin K und damit auch der Carboxylierung. Einige Polymorphismen, die im VKORC1 Gen identifiziert wurden, dürften einen wesentlichen Einfluß auf die Expression des Gens ausüben. Zu den biologisch relevanten Varianten gehört unter anderem der Polymorphismus -1639G>A, der in der Promoterregion von VKORC1 lokalisiert ist. Befindet sich das Nukleotid G an der Position -1639, so ist die Aktivität des Promoters angeblich signifikant höher, als in Anwesenheit des Nukleotids A an Position -1639. Aufgrund früherer Publikationen dürfte auch die Expression von mRNA in Gegenwart der G Variante erhöht sein. Es wurde außerdem festgestellt, dass homozygote Träger des A Allels sensitiver auf das Antikoagulant Warfarin reagieren. Andere Quellen berichten, dass der Polymorphismus -1639G>A keinen Einfluss auf die Expression des VKORC1 Gens ausübt. Es war daher das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss des Polymorphismus in eigenständigen Experimenten zu untersuchen und zu bewerten. Dazu wurden die beiden im Labor zur Verfügung stehenden Konstrukte pGL3-G und pGL3-A verwendet. pGL3-G trug die Promotervariante -1639G, pGL3-A trug hingegen -1639A. Die Konstrukte wurden in HepG2 Zellen transfiziert und die Promoteraktivität anschließend mittels eines Dual Luciferase Reporter Assays ermittelt. Es wurden zwei unterschiedliche Transfektionsmethoden evaluiert. Im Vergleich erzielte das häufig angewandte Reagenz Lipofectamine sehr variable und unzuverlässige Ergebnisse. Das neu entwickelte Metafectene PRO hingegen ergab im Luciferase Assay viel höhere Werte, zeigte jedoch auch eine relativ hohe Schwankungsbreite der Resultate, die allerdings nicht so hoch war wie mit Lipofectamine. Die Ergebnisse, die im Luciferase Assay mit den mit Metafectene PRO transfizierten Zellen erzielt wurden, zeigten nur einen minimalen Unterschied zwischen den beiden Promotervarianten, wobei das Konstrukt pGL3-G geringfügig höhere Promoteraktivität aufwies. Die Expression des Reporter-Gens wurde nicht signifikant durch eine der beiden Promotervarianten beeinflusst. Es besteht allerdings immer noch die Möglichkeit, dass der Polymorphismus -1639G>A die Expression von VKORC1 gewebsabhängig reguliert.

Abstract

(Englisch)

Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1) recycles vitamin K epoxide to reduced vitamin K in the process of the components of the vitamin K cycle. Reduced vitamin K is used as a co-factor for the γ-carboxylation of glutamic acid residues in vitamin K-dependent proteins. These proteins are only active following gamma-carboxylation. VKORC1 is the rate-limiting factor of vitamin K recycling and thus of gamma-carboxylation. Several polymorphisms in the VKORC1 gene have been identified and proposed to have an influence on the expression of the gene. One of these genetic variants is the promoter polymorphism -1639G>A. The G allele is said to be associated with a significantly higher promoter activity and higher expression of mRNA. Additionally, the A allele in homozygous form is associated with increased warfarin-sensitivity. Since there have also been reports that the SNP -1639G>A does not have an influence on the expression of the VKORC1 gene, it was the objective of this study to conduct experiments to re-evaluate the influence of the promoter variation on the expression of the VKOR gene. Two VKORC1 promoter constructs that were available in the laboratory, pGL3-G and pGL3-A, were used for the experiments. pGL3-G contained the G nucleotide at the position -1639, pGL3-A contained the A nucleotide. The constructs were transfected into HepG2 cells and promoter activity was measured in a Dual Luciferase Reporter Assay. Two different transfection methods were evaluated and compared. While the commonly used reagent Lipofectamine produced rather variable and unreliable results the newly developed Metafectene PRO yielded more reproducible results and higher values in the Luciferase Assay. The Luciferase Assay with cells transfected with Metafectene PRO indicated only a minor difference in the promoter activity between the two variants, with G giving slightly higher values. In conclusion, expression of the reporter gene was not significantly influenced by the G or the A version of the promoter in HepG2 cells. However, there is still the possibility that the influence of the SNP -1639G>A is tissue-specific.

Autor*innen

Cornelia Patry

Haupttitel (Deutsch)

The influence of the -1639 G>A promoter variant on the expression of the vitamin K epoxide reductase gene in HepG2 cells

Paralleltitel (Deutsch)

Der Einfluss der -1639G>A Promotorvariante auf die Expression des Vitamin K Epoxid Reduktase Gens in HepG2 Zellen

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

81 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Christine Mannhalter

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.30 Naturwissenschaften in Beziehung zu anderen Fachgebieten

AC Nummer

AC07711565

Utheses ID

3892

Studienkennzahl

UA | 442 | | |

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