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Interaction of tumor necrosis factor-alpha with an antibody and of albumin with cholate investigated by FTIR attenuated total reflection spectroscopy
Norbert Hassler
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Urs Peter Fringeli
DOI
10.25365/thesis.4412
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29614.10755.954364-3
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
FTIR-Spektroskopie, kombiniert mit der Methode der abgeschwächten Totalreflexion (ATR), wird zunehmend zur Erforschung von oberflächennahen Vorgängen benützt. Zur Untersuchung von Biomembranen, Monoschichten und dünnen Filmen werden sehr empfindliche Methoden benötigt, um deren Oberflächenkonzentrationen und molekulare Strukturen zu bestimmen. In dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung zweier Proteine untereinander und eines Proteins mit einem Liganden, die in einer phosphatgepufferten Saline (PBS) gelöst waren, untersucht. Zu diesem Zweck wurden zwei Techniken angewendet: die single-beam-sample-reference (SBSR) Spektroskopie und die konzentrationsmodulierte Anregungs-(c-ME)-Spektroskopie. Gemeinsam führen diese zu optimaler Hintergrund¬kompensation und verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis. Im ersten Teil wird die Erkennung des immobilisierten humanen Tumornekrosefaktors-alpha (TNF-alpha), eines wichtigen Vermittlers der zellulären Immunantwort, durch den monoklonalen Antikörper Infliximab beschrieben. Rinderserumalbumin (BSA) wurde verwendet, um die unspezifische Bindung des Antikörpers an das multiple interne Reflexionselement (MIRE) zu verhindern. Die durch die SBSR-Technik erhaltenen Spektren ermöglichten die Unterscheidung der beteiligten Proteine auf Grund ihrer unterschiedlichen Amid-Banden. Das molekulare Bindungsverhältnis zwischen immobilisiertem TNF-alpha und dem spezifisch gebundenen Antikörper betrug 5.3. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung von Cholat mit adsorbiertem humanem Serumalbumin (HSA) untersucht. Cholat gehört zu den Gallensäuren und ist ein Ligand von HSA, dem am häufigsten vorkommenden Protein im Blut. Um die reversible Reaktion von immobilisiertem HSA auf periodische Konzentrationsänderungen von Cholat zu bestimmen, wurde c-ME-Spektroskopie angewendet. Die Antwort des Protein-Ligand-Systems wurde dabei mittels zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie gemessen und die anfallenden Daten einer phasen-sensitiven Detektion (PSD) unterworfen. Dadurch konnten störende Signalkomponenten, die nicht die gleiche Frequenz wie die Anregung hatten, eliminiert werden. Die erzielte Empfindlichkeit lag im Mikro-Absorbanzbereich, was eine Grundbedingung darstellt, um spezifische Wechselwirkungen auf molekularem Niveau aufzulösen. Um Informationen über Bindungskapazität und Bindungsverhalten zwischen immobilisiertem Serumalbumin und Cholat zu erhalten, wurden die Modulationsexperimente mehrere Male im Cholatkonzentrationsbereich zwischen 0.3 mM und 20 mM durchgeführt. Dabei konnte eine Zunahme alpha-helikaler Strukturen von HSA als Folge der Cholatbindung beobachtet werden. Bindungskurven können auch durch Surface-plasmon-resonance (SPR) erhalten werden. Obwohl die c-ME Spektroskopie höheren experimentellen Aufwand als SPR erfordert, liegt ihr Vorteil im Zugang zu Informationen über strukturelle Änderungen im Rezeptor, die durch die Ligandenbindung verursacht wurden. Der Hintergrundkompensation wurde besondere Aufmerksamkeit gewidmet, um überlappende spektrale Beiträge von gelöstem und an HSA gebundenem Cholat zu trennen.
Abstract
(Englisch)
FTIR attenuated total reflection (ATR) spectroscopy is increasingly used for investigations of processes at or near a surface. Very sensitive techniques are needed, particularly if biomembranes, monolayers, and thin films are studied with respect to surface concentration and molecular structure. In this work the interaction of two proteins and of a protein with a ligand dissolved in a phosphate buffered saline (PBS) was investigated. For this purpose two techniques were used; single beam sample reference (SBSR) spectroscopy and concentration-modulated excitation (c-ME) spectroscopy, resulting in an optimum background compensation and signal-to-noise ratio. First the recognition of immobilized human tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), an important mediator of cellular immune response, by a monoclonal antibody known as Infliximab was studied. Bovine serum albumin (BSA) was used to avoid unspecific bonding of the antibody. Differences in the amide bands enabled the discrimination of the proteins by their spectra obtained by SBSR spectroscopy. The molecular ratio of the bonding between TNF-alpha adsorbed to a multiple internal reflection element (MIRE) and the corresponding antibody resulted in 5.3. In the second part of this work the interaction of cholate with adsorbed HSA was investigated. Cholate belongs to the bile acids and is a ligand of human serum albumin (HSA), the most abundant protein in blood. c-ME spectroscopy was applied to study the reversible reaction of immobilized HSA to periodic changes of the concentration of cholate. The response of the system was measured with time-resolved FTIR spectroscopy and then processed by a phase-sensitive detection (PSD), thus eliminating disturbing signal components, which did not have the same frequency like the excitation itself. The achieved sensitivity was in the micro-absorbance range, a prerequisite for studying specific interactions on a molecular level. In order to get information about bonding capacity and behaviour between immobilized albumin and cholate, modulation experiments were performed several times with concentrations of cholate in the range of 0.3 mM to 20 mM. An increase of alpha-helical structures of HSA was observed upon cholate bonding. Bonding curves are determined usually by surface plasmon resonance (SPR). Although c-ME spectroscopy requires higher experimental effort than SPR, its advantage is the access to information about structural changes in the receptor caused by ligand bonding. Special attention was paid to background compensation in order to separate overlapping spectral contributions of dissolved and HSA-bonded cholate.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
FTIR spectroscopy attenuated total reflection ATR modulation spectroscopy tumor necrosis factor albumin cholate specific interaction antibody
Schlagwörter
(Deutsch)
FTIR-Spektroskopie abgeschwächte Totalreflexion ATR Modulationsspektroskopie Tumornekrosefaktor Albumin Cholat spezifische Wechselwirkung Antikörper
Autor*innen
Norbert Hassler
Haupttitel (Englisch)
Interaction of tumor necrosis factor-alpha with an antibody and of albumin with cholate investigated by FTIR attenuated total reflection spectroscopy
Paralleltitel (Deutsch)
Wechselwirkung von Tumornekrosefaktor-alpha mit einem Antikörper und von Albumin mit Cholat untersucht mit FTIR-abgeschwächter-Totalreflexions-Spektroskopie
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
125 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Wolfgang Lindner ,
Werner Mäntele
AC Nummer
AC05039559
Utheses ID
3913
Studienkennzahl
UA | 091 | 419 | |