Detailansicht

siRNA screen in human cancer cell lines for effective synthetic oligonucleotide (siRNA) combinations with anti-proliferative effects for therapeutic approaches
Volker Baumann
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus d. Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Pharmazie)
Betreuer*innen
Christian Noe ,
Johannes Winkler
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-24235.51481.379378-0
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
In den letzten Jahrzehnten wurden enorme Anstrengungen unternommen um die Krebstherapie zu verbessern, aber es wurden nur relativ moderate Erfolge erzielt. Umfassende Screening Programme und die Zulassung von neuen Wirkstoffklassen, darunter monoklonale Antikörper und Tyrosinkinase-Hemmer haben beachtlichen Erfolg für spezielle Krebstypen erbracht. Dennoch fehlt für die meisten Krebsarten eine effiziente Behandlungsmöglichkeit, das einen dringenden Bedarf an neuen Therapien mit sich bringt. RNA Interferenz ist ein leistungsfähiges Instrument für die Erforschung von molekularen Signalwegen durch spezifischen Gen Knockdown und zur Validierung neuer Ziele für die Tumorbehandlung. Ein in vitro RNAi Screening mit ausgewählten Zielgenen konnte einige Gene identifizieren, die in Entwicklung und dem Wachstum von Tumoren involviert sind. Die erfolgreiche Stilllegung von Zielgenen wurde mittels RT-qPCR verifiziert. Die Evaluierung von fast 70 siRNA Sequenzen zeigte, dass lediglich ein Drittel der von Computeralgorithmen prognostizierten Sequenzen in der Realität mind. 70 % Hemmung hervorriefen. Die siRNAs, die CDC37, GRP78 (HSPA5) und MCL1 zum Ziel hatten, zeigten stark antiproliferative Effekte, die über Zellgrenzen hinweg konserviert sind. In jeder Zelllinie konnte mindestens ein Zielgen identifiziert werden, dessen Inihibition eine Wachstumsreduktion von Zweidrittel überstieg. Charakteristische Unterschiede in der Sensitivität der verschiedenen Zelllinien auf die verwendeten siRNAs spiegeln die Heterogenität dieser Krebstypen wieder. In MDA-MB-468 Zellen konnte erstmals ein antiproliferativer Effekt durch Cofilin1 siRNA nachgewiesen werden. Bis jetzt war die bekannte Genfunktion auf Actin- und Zytoskelettdynamiken begrenzt. In HeLa-Zellen führte die MCL1 siRNA zu fast vollständiger Inhibition der Proliferation. Dieser Effekt wurde im Detail analysiert und zeigte eine essentielle Abhängigkeit von der Verfügbarkeit dieses Gens. Erste apoptotische Zellen traten bereits acht Stunden nach der Behandlung auf und nach 24 Stunden folgte ein totaler Verlust der Viabilität. Zur Untersuchung von potentiellen Synergien und der Interaktion bestimmter Zielgenen wurden Kombinationen aus zwei oder mehreren siRNAs verwendet um verbesserte zytotoxische Effekte zu erzielen. Synergistische Kombinationen konnten mit siRNAs erzielt werden die über einen moderaten Hemmungseffekt verfügen. In HeLa Zellen war speziell CDC37 siRNA in Kombination mit VEGFA siRNA oder verschiedenen miRNAs äußerst erfolgreich mit einem um 60-70% reduzierten Wachstum. Aus den Kombinationsscreenings wurde ersichtlich, dass der zusätzliche Knockdown von Heat Shock Proteinen (HSPs) generell die wachstumshemmende Wirkung anderer siRNAs stark abschwächt. Eine genauere Untersuchung der HSPs zeigte eine starke Korrelation zwischen der Expression des Chaperones GRP78 und der Proliferation von A549 und HeLa Zellen. Einzelne oder multiple Knockdowns mit Interaktionspartnern resultierten in positiven und negativen Effekten auf die GRP78 Expression, wodurch die Identifizierung von vorteilhaften Kombinationen ermöglicht wurde. Die präzise Inhibierung von ausgewählten Zielgenen und die Analyse der beeinträchtigen zellulären Mechanismen erlaubte eine schrittweise Steigerung der antiproliferativen Effekte. Zusätzlich zu antiproliferativen siRNAs konnte durch Kombinationen Synergismus im Sinne von induzierbarer synthetischer Letalität erreicht werden.
Abstract
(Englisch)
Despite immense efforts during the last decades, the success of tumor treatment has only stepwise improved. Comprehensive screening programs and recent new therapy classes, above all monoclonal antibodies and tyrosine kinase inhibitors have had some impact on therapeutic outcomes on some cancer types. However, more effective treatment for the vast majority of tumor types is still urgently required. RNA interference is a powerful scientific tool for investigations of molecular pathways by inducing specific gene knockdown, and for identification of novel potential tumor targets. A continuous small-scale RNAi in vitro screen of cancer related genes with a rationally selected target set identified several genes associated with tumor growth and progression. Successful target knockdown was verified by RT-qPCR. This evaluation of nearly 70 siRNA sequences revealed that only one-third of these siRNA sequences caused indeed a highly effective silencing exceeding 70%. This unexpected result suggested the need for a further improvement of available in silico prediction tools and their algorithms respectively. A high anti-proliferative effect conserved to several cancer cell lines was verified for siRNAs silencing CDC37, GRP78 (HSPA5) and MCL1. For each cell line used a lead candidate siRNA was identified, which caused a reduction of the proliferation rate by at least two thirds. Characteristic response differences between the cell lines to applied siRNAs reflect the high heterogeneity of the used cancer types. In MDA-MB-468 cells for the first time a 40% reduced proliferation rate was verified after silencing cofilin 1 (CFL1), a gene product with annotated functions in actin and cytoskeletal dynamics. The nearly complete loss of viable HeLa cells after MCL1 knockdown was examined in detail and showed the high dependence of this cell line on MCL1 for apoptosis resistance, cell survival and growth. Early apoptotic cells were detected already eight hours after siRNA transfection, and resulted in a complete loss of proliferation after 24 h. The interaction and potential synergy of several distinct targets was investigated by applying siRNA mixtures. In order to achieve stronger and more robust cytotoxic effects, a number of concurrent knockdowns of two or more target genes were screened. Several combinations of siRNAs with moderate anti-proliferative potentials reached synergistic levels. In HeLa cells co-transfecting CDC37 siRNA with diverse miRNAs acted synergistic (60%) and a combination with VEGFA siRNA reduced proliferation around 70%. In addition, it became evident that silencing heat shock proteins (HSPs) in combinations caused rescue effects conserved to all cell lines tested. A detailed investigation on the role of HSPs and chaperones revealed a strong correlation of proliferation with expression levels of the ER chaperone protein GRP78 in A549 and HeLa cells. Single or concurrent knockdown of respective interaction partners showed positive or negative impact on GRP78 expression and proliferation respectively, which allowed defining beneficial target combinations. The silencing of rationally selected targets by analyzing affected cellular mechanisms enabled the stepwise improvement of initial anti-proliferative effects. Additional to lead candidates, combination of siRNAs exceeded synergistic levels of proliferation inhibition in the sense of inducing synthetic lethality.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
siRNA screen human cancer cell lines breast cancer cervical cancer non-small cell lung cancer synthetic lethality oligonucleotide combinations highly anti-proliferative potential
Schlagwörter
(Deutsch)
siRNA Screen humane Krebszelllinien Brustkrebs Zervikalkrebs Nicht Kleinzelliger Lungenkrebs Synthetische Lethalität Oligonucleotid Kombinationen hohes wachstumshemmendes Potential
Autor*innen
Volker Baumann
Haupttitel (Englisch)
siRNA screen in human cancer cell lines for effective synthetic oligonucleotide (siRNA) combinations with anti-proliferative effects for therapeutic approaches
Paralleltitel (Deutsch)
siRNA Screen in humanen Krebszelllinien für effektive synthetische Oligonukleotid (siRNA) Kombinationen mit wachstumshemmenden Effekten zur therapeutischen Anwendung
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
237 Seiten
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Achim Aigner ,
Jonathan Hall
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
42 Biologie > 42.00 Biologie: Allgemeines ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC13392337
Utheses ID
39592
Studienkennzahl
UA | 796 | 610 | 449 |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1