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Integrated metabolome and proteome analysis for the molecular characterization of natural product formation during developmental processes of cacao seed, lotus seed and grape berry
Lei Wang
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Biologie)
Betreuer*in
Wolfram Weckwerth
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-24229.10528.609069-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der Fokus dieser Arbeit liegt auf drei Nutzpflanzen, welche seit jeher großen kulturellen,
medizinischen und ökonomischen Wert besitzen: Theobroma cacao, Nelumbo nucifera and
Vitis vinifera. Kakaobohnen (T. cacao) sind der Grundstoff für Schokoladeproduktion.
Lotussamen (N. nucifera) werden in Asien gerne als Snacks verzehrt, aber spielen auch als
Arzneimittel eine Rolle. Trauben (V. vinifera) werden entweder frisch verzehrt oder zu Saft und
Wein weiterverarbeitet. Deshalb stellen diese, vom Menschen benutzten Teile der Pflanzen
die Studienobjekte der vorliegenden Arbeit dar. Ihnen ist gemeinsam, dass sie hohe
Konzentrationen an Sekundärmetaboliten enthalten, welche einen großen Beitrag zu einer
gesunden Ernährung beitragen. Diese Stoffe werden in den Samen und Früchten während
des Entwicklungsprozesses gebildet, welcher komplexe morphologische, physiologische und
biochemische Änderungen mit sich bringt. In dieser Studie wurden massenspektrometrische
(MS) Methoden angewandt um dynamische Profile von Metabolom und Proteom im Laufe der
Fruchtentwicklung aufzuzeichnen. Um eine möglichst effiziente und umfangreiche Erhebung
der Primär- und Sekundärmetabolite zu gewährleisten wurde ein an eine
gaschromatografische Auftrennung gekoppeltes „Time of Flight“ Massenspektrometer (TOF),
sowie eine an eine flüssigkeitschromatografische Auftrennug gekoppelte Orbitrap MS/MS (LCOrbitrap-MS/MS) eingesetzt. Das Orbitrap MS/MS System wurde auch für die shotgunProteomik Analyse verwendet. Um die Ergebnisse dieser shotgun-Proteomik interpretieren zu
können wurden die Genomsequenzen der jeweiligen Pflanzen zu Hilfe gezogen. Multivariate
statistische Analysen, wie Hauptkomponentenanalyse, Cluster Analyse, sowie die
Berechnung der Granger-Kausalität wurden zur Datenauswertung herangezogen.
Für die erste Studie wurden Kakaobohnen (T. cacao cv. Forastero) in vier verschiedenen
Entwicklungsstadien (Stadium 1-4) in Costa Rica geerntet und verarbeitet. Die Analyse des
Metaboloms und des Proteoms offenbarte eine komplexe Koordination von Primär- und
Sekundärmetabolismus. Vom Embryo bis zur Reife durchlaufen Kakaobohen mehrere Stadien:
Zellteilung und Streckung (Stadium 1 und 2), Einlagerung von Speicherstoffen (Stadium 3) und
die finale Reifungsphase (Stadium 4). In den frühen Entwicklungsstadien (Stadium 1 und 2)
wurde der Transportzucker Saccharose aus dem vegetativen Teil der Pflanze in Fruktose und
Glukose gespalten, was zu einem Anstieg der Level dieser Hexosen in den Früchten führte.
Weiters zeigten Glykolyse und der Zitratzyklus in einem Modellierungsansatz des
Metabolismus verstärkte Perturbationen, was durch die Freisetzung von Energie und
Kohlenstoffbausteinen für die Synthese von Aminosäuren, Lipiden und Sekundärstoffen zu
erklären war. In der dritten Phase wechselte der Saccharose Stoffwechsel zu Raffinose
Synthese, was wiederum zur Akkumulation von Raffinose führte, welche eine wichtige Rolle
als Energiespeicher und kompatibles Solut spielt. Purinalkaloide, wie Theobromin und Koffein welche für den charakteristischen, bitteren Geschmack und das adstringierende Mundgefühl
von Kakaobohnen verantwortlich sind, wurden ab dem dritten Stadium angereichert. Die
Konzentrationen der meisten Aminosäuren, auf der anderen Seite, sanken ab diesem Stadium,
da sie für den Aufbau von Proteinen und Lipiden verwendet wurden. Flavonoide und NPhenylpropenoyl- Aminosäuren (NPPAAs), welche aus dem Phenylpropanoid Metabolismus
stammen, wiesen charakteristische Änderungen in ihren Konzentrationen auf. Die
Konzentrationen aller detektierten NPAAs sank während der Entwicklung der Kakaobohnen,
während die meisten Flavonoide in den reifen Samen akkumulierten. Der Vergleich der aus
der Kovarianz der Metabolitlevels abgeleiteten Einträge der Jakob-Matrizen wies auch auf eine
Neuprogrammierung des Flavonoid- und Phenylpropanoid Metabolismus hin. Eine
signifikante Verlagerung der Proteine von Phenylpropanoid Mmetabolismus zu
Flavonoidsynthese von Stadium 1 zu Stadium 2 ließ auf die Vorbereitung des Enzymapparates
für die Akkumulation von Flavonoiden in den frühen Stadien schließen. In den reifen Samen
dienen die akkumulierten Stoffe wie Raffinose und Flavonoide, zusammen mit Stressassoziierten Proteinen der Verteidigung gegen biotische und abiotische Stressoren.
Lotussamen (N. nucifera cv. Baijianlian) werden entweder frisch oder in getrockneter Form
verzehrt. Es ist bei der Ernte von Lotus essentiell den richtigen Zeitpunkt zu wählen, da die
Samen, wenn sie zu spät geerntet werden stark an Süße verlieren. Der Schwerpunkt dieser
Studie lag darauf, Dynamiken im Metabolismus in Entwicklungsstadien von Lotussamen von
10 bis 25 Tagen nach der Befruchtung (DAP – Days after Pollination) zu untersuchen. Diese
Phase entspricht jener Zeit, in der Reservestoffe im Samen eingelagert werden. Das Volumen
der Samen stieg kontinuierlich bis 20 DAP und sank danach. Die Konzentration löslicher
Zucker wie Glukose und Fruktose erreichte das Maximum um 15 DAP und sank danach wieder
ab. Histologische Befunde zeigten eine schnelle Akkumulation von Stärke und Proteinen von
17- 20 DAP, was einen Umschlagpunkt im Metabolismus zur Akkumulation von
Reservestoffen in diesem Zeitraum andeutete. Daraus folgt, dass Lotussamen um 17 DAP
aufgrund ihrer relativ hohen Süße jenen, die nach 20 DAP geerntet wurden, zum frischen
Verzehr vorzuziehen sind. Die nach 20 DAP geernteten Samen jedoch sind durch den hohen
Stärkegehalt besser dafür geeignet um kulinarisch weiterverarbeitet zu werden. Die
dynamischen Profile der Metabolite und Proteine, welche in Zuckerstoffwechsel, Glykolyse,
Zitratzyklus und Aminosäurestoffwechsel involviert sind stellen einen Referenzdatensatz dar,
der dabei behilflich sein wird den Primärstoffwechsel in der Entwicklung von Lotussamen
besser zu verstehen.
Der Vergleich der Entwicklungsprozesse von Kakaobohnen und Lotussamen zeigte sowohl
Ähnlichkeiten, als auch Unterschiede. So wie andere zweikeimblättrige Pflanzen durchlaufen
Kakao- und Lotussamen ähnliche Entwicklungsstadien: Zellteilung und Expansion, Akkumulation von Speicherstoffen und eine Reifungsphase. Die Aufgabe des
Zuckerstoffwechsels verschob sich vom Bereitstellen von Energie zum Anlegen einer
Energiereserve. Beide Studienobjekte akkumulierten Proteine im Reifungsprozess, jedoch die
Zusammensetzung der gespeicherten Metabolite unterschied sich. In Kakaobohnen wurden
vorwiegend Lipide und Purinalkaloide als Reservestoffe eingelagert, während Lotussamen auf
Stärke setzten.
In der letzten Studie wurden die Metabolom- und Proteomprofile von 12 Entwicklungsstadien
von Weintrauben (V. Vinifera cv. Early Campbell) verglichen. Eine Hauptkomponentenanalyse
der kombinierten Datenmatrix aus Metabolit und Proteinmessungen zeigte eine klare
Entwicklungstrajektorie mit einem Wendepunkt um die Véraison. Die Konzentrationen der
organischen Säuren des zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel stiegen bis zum Punkt der
Véraision und sanken danach wieder ab. Während des Reifeprozesses wurden Zucker und
Anthocyanine in großen Mengen akkumuliert, was den Trauben zu ihrem süßen Geschmack
und ihrer roten Farbe verhalf. Die Ähnlichkeiten im Anthocyaninprofil im Lauf der Entwicklung
der Sorte Early Campbell mit anderen von der Sorte Concord abgeleiteten Weintraubensorten
zeigte den starken Einfluss des genetischen Hintergrunds auf den Stoffwechsel. Die Menge
an anderen Flavonoid- Unterfamilien, wie Proanthocyanine, Flavan-3-ole, Flavonole,
Flavanole und deren Glycoside verringerte sich aufgrund des Wettbewerbs um Vorstufen und
Grundbausteine mit Anthocyaninen. Zum ersten Mal wurde in diesem Zusammenhang eine
„Granger Kausalitäts Analyse“ angewendet um direkte und nichtlineare Zusammenhänge
zwischen Metaboliten und Proteinen im Laufe der Entwicklung der Trauben zu analysieren.
Die Ergebnisse zeigten signifikante Zusammenhänge zwischen Flavonoiden, deren Vorstufen
und den Enzymen, welche in der Flavonoidsynthese involviert sind. Diese Zusammenhänge
waren über die Entwicklungszeit koordiniert und sequentiell angeordnet. Ein ausführliches
Granger Kausalitätsnetzwerk zeigte drei Cluster mit mehreren spezifischen Proteinen,
Aminosäuren (Ornithine, Arginine, Phenylalanine und einige weitere), sowie organische
Säuren (z.B. Shikimisäure) als Knotenpunkte auf, was ihre zentrale Position im Metabolismus
der Trauben hervorhob. Diese Ergebnisse zeigten, zusammen mit aufeinanderfolgenden kmeans Clusterings, im Lauf der Entwicklung eine generelle Verschiebung im Stoffwechsel von
Aminosäuren, Zuckern und Flavonoiden zur Einlagerung von organischen Säuren und
letztendlich der Akkumulation von Lipiden und Athocyanin.
Moderne, massenspektrometriebasierte Platformen erleichterten das Verständnis von
umfassenden metabolischen Dynamiken in der Entwicklung von Samen und Früchten. Diese
Resultate repräsentieren nicht nur die besprochenen Entwicklungsprozesse, sondern stellen
auch Referenzdatensätze für folgende Studien dar. Multivariate statistische Analysen
ermöglichten die Interpretation von biologischen Informationen und deckten komplexe Stoffwechselinteraktionsnetzwerke und bisher unbekannte Zusammenhänge auf. Ein
besseres Verständnis dieser Entwicklungsprozesse wird bei der Kontrolle des Wachstums von
Nutzpflanzen, sowie deren Zucht eine große Rolle spielen.
Abstract
(Englisch)
Plants play vital roles in the natural web of life. Three plants are in the focus of this thesis
including Theobroma cacao, Nelumbo nucifera and Vitis vinifera. These historic crops possess
great cultural, medical and economic values. Cacao seeds are the source for chocolate
production. Lotus (N. nucifera) seeds are widely consumed in Asia countries as snacks and
medicine. Grape (V. vinifera) berries are either consumed freshly or made into juice or wine.
These most valuable consuming parts, i.e. cacao seeds, lotus seeds and grape berries, are
therefore the main study objects. Common to all is their high nutritional value in human diet
with respect to secondary metabolites which are end products of complex developmental
processes. The development and ripening process of seeds and fruits involves morphological
as well as physiological and biochemical changes. Here, mass spectrometry (MS) based
platforms were applied to obtain dynamic metabolome and proteome profiles during
development. For increased metabolomic coverage with a focus on the interface of primary
and secondary metabolism as well as natural product synthesis, gas chromatography coupled
with time of flight MS (GC-TOF-MS) and liquid chromatography coupled with Orbitrap MS/MS
(LC-Orbitrap-MS/MS) platforms were used. Furthermore, LC-Orbitrap-MS/MS analysis was
used for shotgun proteomics. For the shotgun proteomics approach, the genome sequences
of T. cacao, N. nucifera and V. vinifera were used. Multivariate statistical analysis such as
principal component analysis (PCA), clustering analysis and Granger causality analysis were
applied to assist data exploration.
In the first study, cacao seeds (T. cacao cv. Forastero) at four developmental stages (stage 1
to 4) were harvested from Costa Rica. The analysis of the metabolome and proteome data of
developing cacao seeds revealed a complex consecutive coordination of primary and
secondary metabolism. From embryo to mature beans, cacao seeds undergo cell division and
expansion (stage 1 and 2), reserve accumulation (stage 3) and maturation phases (stage 4).
At early developmental stages (stage 1 and 2), the transported sucrose was predominantly
hydrolyzed to fructose and glucose leading to an increase in these hexoses. Further, glycolysis
and the tricarboxylic acid (TCA) cycle showed enhanced perturbations by a metabolic
modelling approach suggesting the liberation of energy and carbon skeletons for the synthesis
of amino acids, lipids and secondary metabolites. At stage 3, sucrose metabolism switched to
raffinose synthesis and resulted in the accumulation of raffinose that plays roles as energy
storage reserves and osmoprotectants. Purine alkaloids such as theobromine and caffeine
started to accumulate since stage 3 endowing cacao seed bitter taste and astringent mouthfeel.
Most of the amino acids, on the contrary, declined at this stage due to the incorporation into
synthesis of proteins and lipids. Flavonoids and N-phenylpropenoyl amino acids (NPPAAs)
that both derive from phenylpropanoid pathway showed distinct changing patterns. All the detected NPPAAs decreased during cacao seed development whereas most of the detected
flavonoids accumulated in mature seeds. Stage-specific comparison of co-variance derived
Jacobian entries also indicated the reprogramming of flavonoids and NPPAAs metabolism.
Significant shift of proteins from phenylpropanoid metabolism to flavonoid synthesis from stage
1 to stage 2 indicated the preparation of precursors and enzymes for flavonoid synthesis at
early developmental stages. Finally, in the mature seeds, the accumulated raffinose,
flavonoids together with high abundance of stress related proteins synergistically protected the
seeds against biotic and/or abiotic stresses.
Lotus seeds (N. nucifera cv. Baijianlian) are consumed either freshly or in a desiccated form.
It is essential for lotus production to address the transition phase from the fresh consumption
stage to the reserve filling stage. Our study focused on metabolic dynamics of developing lotus
seed from 10 to 25 days after pollination (DAP) which correspond to the reserve accumulation
phase. The volume of lotus seeds continuously expanded until 20 DAP. Soluble sugars such
as glucose and fructose were most abundant around 15 DAP and decreased afterwards.
Histological results showed a rapid accumulation of starch and proteins from 17 to 20 DAP
indicating a metabolic switch to a reserve accumulation phase during this period. Therefore,
lotus seeds at around 17 DAP with a relatively high sweetness are suitable for fresh
consumption whereas those harvested after 20 DAP with high content of starch are better to
be processed to snacks or used in cuisines. The dynamic profiles of metabolites and proteins
involved in sugar metabolism, glycolysis pathway, TCA cycle and amino acid metabolism
provide a reference data set for understanding the primary metabolism during lotus seed
development.
The comparison of developmental processes of cacao seeds and lotus seeds showed
similarities as well as differences. Like other dicotyledonous plants, cacao and lotus seeds
went through similar developmental stages i.e. cell division and expansion stage, reserve
accumulation stage and maturation stage. Their sugar metabolism switched from energetic
mode to energy storage mode from cell division and expansion phase to reserve accumulation
phase. Both of them accumulated proteins during their ripening. However, their preferred
reserves are different. Cacao seeds predominantly accumulated lipids and purine alkaloids
whereas lotus seeds mainly accumulated starch.
In the last study, proteome and metabolome profiles were obtained from grape berries (V.
vinifera cv. Early Campbell) at 12 developmental stages from fruit set until maturation. PCA of
the integrated metabolomic and proteomic data matrix showed a pronounced developmental
trajectory with a turning point around veraison. The organic acids involved in central carbon
metabolism increased before veraison and decreased afterwards. During ripening, sugars,
especially fructose together with anthocyanins strongly accumulated endowing grape berry sweet taste and reddish color. The similarity of anthocyanin profile of Early Campbell with other
Concord derived varieties emphasized the strong influence of the genetic background to
metabolism. The content of other flavonoid subfamilies such as proanthocyanins, flavan-3-ols,
flavonols, flavanonols and their glycosides decreased due to the competition of precursors with
anthocyanins. For the first time a novel type of statistical analysis called “Granger causality
analysis” was applied for interpreting directed and non-linear correlations between metabolites
and proteins during the time course of grape berry development. The results revealed
significant Granger causations between flavonoids with their precursors and enzymes
indicating time-lagged sequential coordination of precursors, enzymes and products. A
comprehensive Granger causality network showed three main clusters with several specific
proteins, amino acids (ornithine, arginine, phenylalanine and several others) as well as organic
acids (e.g. shikimic acid) as hubs highlighting their central position in grape berry metabolism
during development. The consecutive k-means clustering analysis with Granger causality
analysis presented a general shift in metabolism from amino acids, sugars and flavonoids to
organic acids accumulation and finally to lipid and anthocyanin accumulation from grape berry
fruit set up to maturation.
High throughput mass spectrometry based platforms facilitated the exploration of genomewide metabolic dynamics during seed and fruit development. These results not only present
the developmental processes of cacao seed, lotus seed and grape berry on both metabolite
and protein level but also provide reference data sets for further study. Multivariate statistical
analysis assisted in the interpretation of biological information and revealed complex metabolic
interaction networks and novel metabolic relationships from genome-scale datasets during
developmental processes. Better understanding of these developmental processes will be
helpful in crop growth monitoring, breeding and quality control.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Theobroma cacao Nelumbo nucifera Vitis vinifera seed development grape berry development mass spectrometry metabolomics proteomics
Schlagwörter
(Deutsch)
Theobroma cacao Nelumbo nucifera Vitis vinifera Samenentwicklung Weintrauben Reifung Massenspektrometrie Metabolomics Proteomics
Autor*innen
Lei Wang
Haupttitel (Englisch)
Integrated metabolome and proteome analysis for the molecular characterization of natural product formation during developmental processes of cacao seed, lotus seed and grape berry
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
121 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Young Choi ,
Břetislav Brzobohatý
AC Nummer
AC13392468
Utheses ID
39593
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 437 |