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Molecular interactions of human skin and pathogenic microorganisms

Arby Abtin

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*innen

Erwin Tschachler ,

Werner Lubitz

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DOI

10.25365/thesis.4469

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29713.24728.713559-1

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Antimikrobielle Peptide sind ein wichtiger Teil des angeborenen Immunensystems der Haut. Epidermale Keratinozyten exprimieren eine Vielzahl verschiedener antimikrobielle Peptide, die eine schützende Barriere zu eindringenden Mikroorganismen bilden. Es wurde gezeigt, dass speziell das antimikrobielle Peptide S100A7c (Psoriasin) höchst effektiv gegen den humanpathogenen Keim Escherichia coli (E. coli) wirkt. Der genaue Mechanismus, der für die Regulation dieses antimikrobiellen Peptids in epidermalen Keratinozyten verantwortlich ist, war jedoch bis dato unklar. Deshalb untersuchten wir den Einfluss von verschiedenen mikrobiellen Bestandteilen auf die Expression von S100A7c. Wir konnten nachweisen, dass ausschließlich Flagellin, ein Ligand für Toll-like Rezeptor (TLR) 5, die Expression von S100A7c in primären humanen Keratinozyten stark induzierte, während alle weiteren TLR-Liganden keine Wirkung zeigten. Weiters konnten wir zeigen, dass hitzeinaktivierte Kulturüberstände von E. coli die mRNA- und Proteinproduktion von S100A7c stark induzierten. Im Gegensatz dazu hatte ein flagellin-defizienter E. coli Stamm (deltaFliC) keine induzierende Wirkung. Nun wollten wir untersuchen, ob auch hier die Signalweiterleitung über den TLR5 erfolgt. Durch Transfektion von TLR5 spezifischen siRNAs konnte die Expression dieses Rezeptors in Keratinozyten nahezu vollständig unterdrückt werden. Nach darauffolgender Stimulation mit Flagellin oder hitzeinaktivierte Kulturüberstände von E. coli, konnten wir keine Induktion von S100A7c mehr feststellen. Wir konnten daher durch diese Serie von Experimenten nachweisen, dass das antimikrobielle Peptid S100A7c in primären humanen Keratinozyten über TLR5 Aktivierung induziert wird, und dass Flagellin der bakterielle Bestandteil ist, der für diese Induktion notwendig ist. Ein weiteres antimikrobielles Peptid, das von humanen Keratinozyten produziert wird ist RNase 7. Diese RNase trägt nicht nur zur Oberflächenribonukleasetätigkeit der menschlichen Haut bei, sondern ist vielmehr auch ein wichtiger Faktor für die antimikrobielle Abwehr an der Hautoberfläche. Mittels RT-PCR konnten wir zeigen, dass zusätzlich zu RNase 7, auch andere RNasen (RNasen 1, 4 und 5) sowie ein RNase-Inhibitor (RI) von humanen Keratinozyten produziert werden. RNase-Inhibitoren sind endogene Proteine, die die Aktivität von RNasen blockieren können. In vitro Experimente zeigten, dass dieser RI, sowohl die Ribonukleaseaktivität von Stratum corneum (SC) RNasen, als auch die antibakterielle Wirkung von RNase 7 und RNase 5 unterdrücken konnte. In vivo konnten wir eine starke Expression von RI in den granulären Schichten, jedoch nicht in der verhornten Schicht der Epidermis nachweisen. Weiters konnten wir zeigen, dass SC Extrakte in der Lage waren rekombinant hergestellten RI abzubauen. Dies konnte durch Zugabe von Aprotinin, welches die Aktivität von Serinproteasen inhibiert, verhindert werden. Diese Ergebnisse deuten stark auf das Bestehen physiologischer Mechanismen zum Abbau von RI im SC hin, wodurch sowohl die Ribonukleaseaktivität als auch die antimikrobielle Aktivität von RNasen an der Hautoberfläche gewährleistet werden kann. Zusammengefasst, konnten wir mit diesen Studien neue Einblicke in die Wirkungs- mechanismen und Regulation von antimikrobiellen Peptiden in der menschlichen Haut geben. Weiters konnten wir einen neuen wichtigen Aspekt der proteolytischen Aktivität von SC in der Haut demonstrieren.

Abstract

(Englisch)

Antimicrobial peptides are a critical part of the innate immune system of the skin. Epidermal keratinocytes (KCs) express numerous such peptides which establish a protective barrier to invading microorganisms. The antimicrobial peptide S100A7c (psoriasin) is the most efficient killer of Escherichia coli, but the regulatory mechanism of S100A7c in KCs was unclear. We investigated the responsiveness of S100A7c expression to microbial components and found that flagellin, a ligand for Toll-like receptor (TLR) 5, strongly induced the expression of S100A7c whereas all other TLR ligands had no significant effect on S100A7c mRNA expression. Supernatant from wild-type E. coli, but not from a flagellin-deficient E. coli strain (deltaFliC), strongly induced S100A7c mRNA as well as protein expression, identifying flagellin as the principal S100A7c inducing component of E. coli supernatant. In line with this finding, small interference RNA-mediated knock-down of TLR5 expression suppressed the ability of KCs to up-regulate S100A7c mRNA and protein expression in response to flagellin or E. coli supernatant suggesting that this up-regulation is mediated via TLR5 signaling. RNase 7, another antimicrobial peptide expressed by KCs, not only contributes to the surface ribonuclease activity of human skin but also participates to the cutaneous antimicrobial defense. RT-PCR screening revealed that in addition to RNase 7 epidermal KCs expressed RNases 1, 4 and 5 as well as RNase inhibitor (RI), an endogenous protein that blocks the ribonucleolytic activity of RNases. In vitro assays demonstrated that RI suppresses the ribonuclease activity of stratum corneum (SC) RNases as well as the anti-bacterial activity of RNase 7 and the Candida-cidal activity of RNase 5. RI is strongly expressed by the granular layers of the epidermis whereas it was not detectable in the SC. Co-incubation experiments with SC extracts led to degradation of RI protein which could be prevented by the serine protease inhibitor aprotinin. This finding suggests the existence of a physiological mechanism of RI breakdown in the SC to facilitate skin surface ribonuclease and antimicrobial activity. Taken together these data bring new insights into the regulatory mechanisms of skin-derived antimicrobial peptides and demonstrates the importance of SC proteolysis activity for establishing appropriate RNase-dependent antimicrobial functions of the skin.

Autor*innen

Arby Abtin

Haupttitel (Englisch)

Molecular interactions of human skin and pathogenic microorganisms

Paralleltitel (Deutsch)

Molekulare Interaktion der menschlichen Haut mit pathogenen Mikroorganismen

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

102 S. : graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Regine Gläser ,

Mathias Müller

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,

44 Medizin > 44.93 Dermatologie

AC Nummer

AC05039859

Utheses ID

3968

Studienkennzahl

UA | 091 | 441 | |

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Schlagwörter