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Recombinant expression and purification of two pentose phosphate pathway associated carbohydrate kinases
Shpk and FGGY
Hannes Kessler
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Oswald Wagner
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-25686.76836.843360-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Der Energiestoffwechsel bezeichnet die Gesamtheit aller Stoffwechselwege die der Bereitstellung von zellulärer Energie dienen und ist von fundamentaler Bedeutung für alle Lebewesen. Neben Fetten und Proteinen zählen Kohlenhydrate zu den wichtigsten Energielieferanten und Energiereserven, darüberhinaus üben Kohlenhydrate auch wichtige strukturelle Funktionen aus. Die Regulierung des Kohlenhydratstoffwechsels wird durch Kinasen kontrolliert. Diese Enzyme sorgen mittels Phosphorylierung für die Aktivierung der Kohlenhydrate, die dadurch für den zellulären Stoffwechsel zugänglich werden. Das gesamte Spektrum der Kinasen und deren spezifischen Substrate im Kohlenhydratstoffwechsel ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Die kürzlich entdeckte Sedoheptulose-Kinase (Shpk) erweiterte unser Wissen über den Metabolismus von Kohlenhydraten. Sedoheptulose ist eine in Obst und Gemüse vorkommende Ketoheptose und kann durch die Shpk vermutlich direkt als Kohlenstoffquelle für den zellulären Stoffwechsel verwertet werden. Daher wird die Shpk als neues regulatorisches Element im Pentose-Phosphat-Weg und der Glykolyse angesehen. Eine vorhergesagte und bisher wenig charakterisierte Kohlenhydrat-Kinase ist FGGY, deren Substrat noch unbekannt ist. In dieser Masterarbeit präsentiere ich die rekombinante Expression und die darauffolgende affinitäts-chromatographisch basierende Aufreinigung der Sedoheptulose-Kinase in großen Mengen um folglich Kristallisationsexperimente zu ermöglichen. Ziel ist somit die Aufklärung der 3D Proteinstruktur der Kinase, was zu einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen hinter der molekularen Funktion der Shpk beitragen soll. Weitere Experimente beinhalten die rekombinante Expression und Aufreinigung der FGGY-Kinase und die Identifikation von Ribulose, eine Ketopentose, als potenzielles Substrat von FGGY. Diese Entdeckung, dass Ribulose durch die FGGY-Kinase möglicherweise direkt als Kohlenstoffquelle genutzt werden kann, könnte für ein tieferes Verständnis des Kohlenhydrat Stoffwechsels beitragen. Die FGGY-Kinase könnte ein zusätzliches regulatorisches Element im Pentose-Phosphat-Weg bedeuten.
Abstract
(Englisch)
Energy metabolism is a fundamental process for all living organism to gain und utilize energy in order to survive and maintain cellular functions. A primary fuel source of most cell types consist of carbohydrates, whose metabolization provides energy as well as crucial structural elements for cell maintenance, growth, activation and proliferation. The regulation of carbohydrate metabolism, important for the proper preservation of cellular energy balance, is controlled by kinases. These enzymes represent pivotal elements, by making carbohydrates accessible to metabolism and by further regulating the activity of multiple biochemical pathways. The full spectrum of kinases as well as their substrates involved in carbohydrate metabolism is however not completely understood yet, the recent and unexpected discovery of the sedoheptulose kinase (Shpk, also known as CARKL) expanded our knowledge regarding carbohydrate metabolism and its regulation. Shpk may allow the direct metabolic utilization of free sedoheptulose, which is commonly found in fruits and vegetables, and is proposed to be a novel regulatory element of the pentose phosphate pathway and glycolysis. In addition to sedoheptulose, additional novel carbohydrate sources may also be relevant for primary carbohydrate metabolism, as suggested by the previously uncharacterized carbohydrate kinase FGGY. During my master thesis, I used a pre-established recombinant protein expression and affinity chromatography based purification system and bacterial clones expressing Shpk and FGGY to produce proteins in milligram (mg) quantities, in order to allow crystallization experiments to ultimately resolve the protein structure. This may help to clarify the biochemical mechanism behind the molecular function of these two kinases. Furthermore I used the purified recombinant human FGGY to characterize the ketopentose ribulose as the substrate of this kinase. The identification of ribulose as a relevant direct carbohydrate source and therefore the revelation of FGGY kinase as a novel regulator of cellular metabolism expands our understanding about carbohydrate metabolism and may further broaden our knowledge about diseases associated with disturbances of metabolisms, such as diabetes, atherosclerosis, cancer as well as various inflammatory disorders.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Protein purification kinases pentose-phosphate-pathway
Schlagwörter
(Deutsch)
Proteinaufreinigung Kinasen Pentose-phosphat-weg Kristallisation
Autor*innen
Hannes Kessler
Haupttitel (Englisch)
Recombinant expression and purification of two pentose phosphate pathway associated carbohydrate kinases
Hauptuntertitel (Englisch)
Shpk and FGGY
Paralleltitel (Deutsch)
Rekombinante expression und Aufreinigung von zwei Pentose-phosphat-weg assoziierten Kohlenhydrat-kinasen : Shpk und FGGY
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
62 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Oswald Wagner
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC13434090
Utheses ID
39973
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1