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The environmental detection of comammox Nitrospira

Clemens Schauberger

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie

Betreuer*in

Holger Daims

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DOI

10.25365/thesis.45220

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-25687.57049.483461-4

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Vor kurzem wurden die ersten Mikroorganismen entdeckt, die in der Lage sind Ammonium komplett zu Nitrat zu oxidieren (‘comammox’), und dadurch das Dogma, über die Arbeitsteilung in der Nitrifikation in zwei aufeinanderfolgenden Schritten, für ungültig erklärt. Interessanterweise gehören alle bisher beschriebenen comammox Mikroorganismen zu dem Genus Nitrospira und sind nicht monophyletisch innerhalb der Nitrospira Linie II verteilt, welche einige der am häufigsten vorkommenden Nitrit oxidierenden Bakterien der Welt beinhält. Comammox Nitrospira amoA Gene sind von den amoA Genen der Ammonium oxidierenden Bakterien und Archaeen unterscheidbar, und daher eignen sie sich als phylogenetische und funktionelle Markergene für die Detektion und Quantifizierung von comammox Nitrospira. Bisherige metagenomische Studien zeigten, dass comammox amoA Gene zwei monophyletische Schwester Gruppen bilden, welche mittlerweile clade A und B genannt werden. In dieser Studie wurde ein molekularbiologischer Ansatz für die Detektion von comammox Nitrospira in Umweltproben entwickelt, in dem zwei spezifische PCR Primer Paare entworfen wurden, die jede dieser Gruppe einzeln erfassen. Um eine ausreichend hohe Abdeckungen der Referenz Sequenzen zu erzielen, enthalten beide Primer Paare an mehreren Positionen in ihren Sequenzen degenerierte Nukleotide. Um die daraus folgenden Konsequenzen zu minimieren, mischte ich äquimolar einzelne Varianten der Primer zu neuen Primer Paaren und zeigte ihre erhöhte Amplifikationseffizienz im Vergleich zu den gewöhnlichen degenerierten Primer Paaren. Anschließend bewies ich die Anwendbarkeit der Primer Paare auf Umweltproben mit Klon- Sanger Sequenzierung, und bestätigte die weite Verbreitung von comammox Nitrospira in der Umwelt. Weil sich das Protokoll der DNA Extrahierung auf die beobachtete Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft auswirkt, evaluierte ich den Unterschied zwischen zwei Methoden, welche auf mechanischer Zelllyse basieren, für die anschließende Amplifikations- Effizienz von comammox amoA Genen. Wenn gleiche Mengen von DNA angewandt werden, zeigt das „MoBio PowerSoil DNA Extraction Kit“ interessanterweise die besseren Resultate, verglichen zu einer Phenol/Chloroform Methode. Für die Mehrzahl an Proben jedoch erzielt die Phenol/Chloroform Methode einen höheren DNA Ertrag. Mit dieser Studie ebnete ich den Weg für zukünftige PCR basierende Studien (wie zum Beispiel Amplikon Sequenzierung) über die globale Verbreitung von comammox Nitrospira, welche das Verständnis der Nischenteilung zwischen nitrifizierenden Mikroorganismen fördern können.

Abstract

(Englisch)

With the recent discovery of the first microorganisms capable of complete ammonia oxidation to nitrate (‘comammox’), the dogma on the division of labor in nitrification into two consecutive steps was proven invalid. Intriguingly all so far described comammox microorganisms are dispersed non-monophyletically within Nitrospira lineage II, which is well known for harboring some of the most predominant nitrite oxidizing bacteria on the planet. Comammox Nitrospira amoA genes are phylogenetically distinct from the variants of ammonium oxidizing bacteria (AOB), or archaea (AOA), thus suitable marker genes for its detection and enumeration. Previous metagenomic investigations revealed that comammox amoA genes are forming two monophyletic sister groups, now referred to as clade A and B. In this study, a molecular approach for the environmental detection of comammox Nitrospira amoA genes was developed and optimized, by the design of two highly specific PCR primer sets that target each clade individually. In order to achieve a reasonable coverage of reference sequences, both primer pairs contain multiple ambiguous nucleotide positions. To counteract the consequences of primer degeneracy, I established equimolar primer mixtures of the individual primer variants with high coverages and showed their superior amplification efficiency in comparison to the conventional degenerated primer sets. Subsequently, I performed a proof of principle environmental screen by clone sequencing and thereby underlined the broad habitat spectra of comammox Nitrospira. Since DNA extraction protocols also have an influence on the observed microbial community compositions, I evaluated the difference of two bead beating based methods to the subsequent amplification efficiency of comammox amoA genes. By the application on equal amounts of template DNA, the MoBio PowerSoil DNA extraction Kit intriguingly showed better results for one sample compared to a phenol/chloroform method. However for the majority of specimens, the phenol/chloroform method yields excessively more DNA. This study paved the way for future PCR-based (e.g. next generation amplicon sequencing) studies about the global distribution of comammox Nitrospira and the understanding of niche partitioning between nitrifying microorganisms.

Autor*innen

Clemens Schauberger

Haupttitel (Englisch)

The environmental detection of comammox Nitrospira

Paralleltitel (Deutsch)

Detektion von comammox Nitrospira in der Umwelt

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

78 Seiten : Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Holger Daims

Klassifikation

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC13473518

Utheses ID

40020

Studienkennzahl

UA | 066 | 830 | |

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