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Luciferase based reporter gene assays for investigating nucleic acid delivery in vitro

Katharina Thekla Müller

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Manfred Ogris

Mitbetreuer*in

Haider Sami

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DOI

10.25365/thesis.45331

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-15439.22348.210662-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Wesentliche Fragestellungen der gentherapeutischen Forschung betreffen heutzutage die Sicherheit als auch die Transport- sowie die Transfektionseffizienz in Zielgewebe im Organismus. Nicht-virale Vektoren weisen im Gegensatz zu viralen Vektoren den Vorteil auf, weder eine insertionelle Mutagenese noch eine schwere Immunreaktionen im Empfänger hervorzurufen. Polyplex-Nanopartikel – bestehend aus einem kationischen Polymer komplexiert mit Nukleinsäuren – werden sowohl für den in vivo Transport von DNA als auch von siRNA benutzt. In der vorliegenden Diplomarbeit wurden spezifische Aspekte von Luciferase-basierten Reportergen-Assays für Nanopartikel-vermittelten Transport in Zellen untersucht. Biolumineszenz-basierte Reportergen-Assays, die entweder intrazellulär lokalisierte oder aktiv sezernierte Luciferasen nutzen, wurden eingesetzt um die Effizienz des in vitro Transports zu untersuchen. Eine Aufgabenstellung der Diplomarbeit betraf die Optimierung der hausgemachten Puffersysteme sowohl für Firefly-basierte als auch für Gaussia/Lucia-basierte Reportergen-Assays. Die Aktivität hausgemachter Puffersysteme wurde sowohl mit Hilfe rekombinanter Firefly und Gaussia Luciferasen als auch mit transient in vitro exprimierten Luciferasen (von Firefly oder Gaussia) überprüft. Es konnte festgestellt werden, dass hausgemachte und kommerziell erhältliche Substrate eine annähernd gleiche Aktivität aufweisen; hausgemachte Puffer können daher die teuren kommerziellen Puffer ersetzen. Weiters wurde für den Firefly Luciferase Assay festgestellt, dass der hausgemachte Puffer auch bei -80°C gefroren gelagert werden kann ohne dass es dabei zu einer wesentlichen Aktivitätsminderung kommt. Dies ermöglicht es den Puffer im Vorhinein herzustellen und gefroren in Form von Aliquoten zu lagern, was zeitsparend ist und Reproduzierbarkeit garantiert. Ein weiteres Ziel der Diplomarbeit war die Optimierung des BCA Assays, der für die Normalisierung der Lumineszenz des Firefly Luciferase Assays herangezogen wird. Es wurde festgestellt, dass 30 µl 1X Passive Lysis Buffer für eine Lyseperiode von 30 Minuten zur vollständigen Lyse ausreichen. Der Zusatz von Iodacetamid beeinflusst den BCA Assay dabei nicht wesentlich. Generell hängt die gemessene Proteinmenge im Lysat wesentlich von der Art des eingesetzten Lysepuffers ab. Im Zuge weiterer Experimente wurden die Herstellungs- und Lagerungsbedingungen des Substrats Coelenterazine für Gaussia und Lucia optimiert. Da beide Luciferasen in den Überstand sezerniert werden, kann die Lumineszenz auch auf die Zahl lebender Zellen normalisiert und mit dem BCA Assay, der auf die Proteinmenge normalisiert, verglichen werden. Beide Normalisierungsmethoden führten zu akzeptablen Resultaten. Ein Vorteil der Durchflusszytometrie ist, dass nicht nur die Transfektionseffizienz sondern auch zytotoxische Effekte der Polyplexe detektiert werden können. Nach Optimierung einiger die Luciferase Assays beeinflussender Parameter wurden mögliche Anwendungen dieser Assays untersucht. In einer Anwendung wurde die Herunterregulation der Genexpression von Firefly Luciferase mittels siRNA untersucht, wobei kommerzielles Lipofectamine als Transfektionsreagens benutzt wurde. Ebenso wurde Liposomen-vermittelter siRNA-Transfer untersucht, wobei dieser allerdings in einer nicht ausreichenden Inhibition der Luciferase-Expression resultierte. Weitere in-vitro Experimente sind nötig. In einer anderen Anwendung wurden beide Luciferase Assays in einem dualen Luciferase Assay kombiniert. Dabei wurde eine Co-Transfektion von Firefly und Gaussia Luciferasen durchgeführt und die Robustheit beider Assays gegenüber kleineren Änderungen der Experimentalbedingungen bestätigt. Weiters wurde die Transfektionseffizienz von stabilisierten LPEI-basierten Polyplexen untersucht, die zuvor bei -80°C eingefroren wurden. Der Zusatz des Kryoprotektivum Hydroxypropylbetacyclodextrin führt zu einer leicht höheren Transfektionseffizienz in vitro, es konnten jedoch auch vermehrt zytotoxische Effekte beobachtet werden. Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Diplomarbeit die Optimierung zahlreicher Aspekte von Luciferase Assays in der gentherapeutischen Forschung und untersucht ihre Robustheit im Zuge von Anwendungen des in vitro Nukleinsäuretransports.

Abstract

(Englisch)

Currently, major aspects of gene therapy research are safety aspects as well as questions concerning efficient delivery and transfection of target cells. Non-viral gene delivery vectors do not bear the risk of insertional mutagenesis or severe immune response from the host, compared to their viral counterparts. Polyplex nanoparticles, consisting of a cationic polymer complexed with nucleic acids, are used for delivery of DNA as well as siRNA in vivo. In this diploma thesis, several technical aspects of luciferase based reporter gene assays for nanoparticle mediated nucleic acid delivery into cells were studied. Bioluminescent reporter gene assays, utilizing two different luciferases (intracellular and secreted), were used to monitor efficiency of delivery in vitro. One objective was to optimize housemade buffer systems for both Firefly and Gaussia/Lucia luciferase based reporter gene assays. Housemade and commercial buffers were analyzed for a variety of parameters to test their efficiency for luciferase assay. Luciferases employed for testing the performance of housemade buffer systems included both recombinant luciferase proteins (Firefly or Gaussia luciferase) and in vitro transfected cells transiently expressing luciferases (Firefly or Gaussia). Both housemade buffer systems performed as good as their respective (and expensive) commercial counterparts and thus can be reliably used for such assays. In case of housemade buffer for Firefly assay, it was found that housemade substrate, either freshly prepared or stored at -80°C, can reliably replace the expensive commercial substrate. Thus, preparing the substrate in advance and storing aliquots in frozen form is time-saving and guarantees reproducibility. A further objective was optimizing the BCA assay, which is used for protein normalization of luminescence light signals in Firefly luciferase assay. We found that 30 µl 1X Passive Lysis Buffer was efficient enough to lyse cells within 30 min shaking and additional iodoacetamide is not needed. In conclusion, the amount of protein in the lysate is influenced by many factors, mainly depending on the applied cell lysis buffer. In other optimization experiments for secreted luciferase based reporters, Gaussia and Lucia luciferase assays were evaluated regarding their coelenterazine substrate. As Gaussia and Lucia luciferases are secreted into the supernatant, normalization of their emitted light signals by total count of live cells (from flow cytometry) was also investigated and compared with the BCA assay based normalization. Both normalization methods were shown to give acceptable results. Flow cytometry has the additional advantage of multiplexing within the same experiment e.g. detecting cytotoxic effects of polyplexes on cells in addition to their transfection ability. After optimization of several assay parameters, applications of optimized luciferase assays were explored. In one application, knockdown of Firefly luciferase signal by siRNA delivery was investigated, utilizing a commercial lipofectamine. In a similar second application, cationic liposome mediated siRNA delivery to cells was explored, but knockdown of luciferase expression was not sufficient and further in vitro experiments are needed. Furthermore, both assay buffer systems were combined in a dual luciferase assay and co-transfection of Firefly and Gaussia was analyzed confirming their robustness. Employment of these buffer systems for gene delivery investigations was performed to study transfection efficiency of frozen LPEI based polyplexes. Polyplexes stabilized with a cryoprotectant (HP-β-CD) showed slightly higher transfection efficiency in vitro than non-stabilized polyplexes. However, cytotoxicity was also higher. In summary, the present diploma thesis describes the technical optimization of several aspects of luciferase assays used in gene delivery research and explores its robustness by using it for different in vitro nucleic acid delivery applications.

Autor*innen

Katharina Thekla Müller

Haupttitel (Englisch)

Luciferase based reporter gene assays for investigating nucleic acid delivery in vitro

Paralleltitel (Deutsch)

Luziferase-basierte Reportergen-Assays zur Untersuchung des Nukleinsäuretransports in vitro

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

140 Seiten : Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Manfred Ogris

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

35 Chemie > 35.71 Biochemische Methoden ,

42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,

44 Medizin > 44.42 Pharmazeutische Chemie

AC Nummer

AC13459586

Utheses ID

40119

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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Schlagwörter