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Investigating the mechanism of host translation shut off by human rhinovirus 2A proteinases
Öykü Üzülmez
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Biologische Chemie
Betreuer*in
Timothy Skern
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.45410
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-26748.28662.284173-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Der Begriff Picornaviren stammt von dem Wort “pico” (bedeutet geringe Menge in Spanisch) und RNA. Diese sehr kleinen Viren sind verantwortlich für Schnupfen und Erkältung, und besitzen keine Hülle. Sie weisen eine Ikosahedrale Symmetrie auf und genomische RNA auf. Humane Rhinoviren (HRV) gehören zu der Familie der Picornaviridae innerhalb der Gattung Enteroviren. Die einzelsträngige RNA ist vom Ikosahedralen Kapsid umhüllt, um die viralen Gene zu stützen. Es gibt nur einen offenen Leserahmen, von dem ein einzelnes Polyprotein abgelesen wird. Das Polyprotein wird danach prozessiert, um erwachsene virale Proteine zu erhalten. Zunächst spaltet sich wahrend der Translation HRV 2Apro vom Polyprotein ab. Diese Prozessierung wird zwischen dem N-Terminus der Proteinase und dem C-Terminus des davorliegenden Proteins VP1 durchgeführt. Die restlichen Schritte der Prozessierung werden bei den anderen Proteinasen 3Cpro und 3CDpro durchgeführt, daher liegen schlussendlich elf fertig prozessierte virale Proteine vor. Es gibt drei Arten von humanen Rhinoviren (genetische Gruppen A, B, C), die nach Krankheitssymptomen, der genetischen Divergenz und dem Ort der Replikation klassifiziert werden. In dieser Arbeit wird der Unterschied zwischen 2Apro aus unterschiedlichen genetischen Gruppen (A und B) vergleichen. Deswegen haben wir in vitro biochemische und biophysikalische Experimente durchgeführt mit 2Apro von HRV1A und HRV4 durchgeführt, um die strukturelle Homologie zu verstehen. Zunächst haben wir rekombinante 2Apro des HRV1A Subtyps durch Überexpression erzeugt. Die Aktivität der Proteinase wurde mit den eukaryotischen Initiationsfaktoren getestet (eIF4E und eIF4GII51-745: Aminosäurereste zwischen 551-745 besitzen den Bindungsort der eIF4E und die Prozessierungsstelle der 2Apro). Wir konnten bestätigen, dass die 2Apro bei den Subtypen HRV1A und HRV2 gleich effizient ist. Die inaktivierte (C106A) HRV1A 2Apro wurde für die Bindungsstudien benutzt. Hier fanden wir heraus, dass die Fähigkeit der Bindungsinteraktion für beide Proteinasen der genetischen Gruppe A gleichartig ist. Die Proteinasen von HRV1A und HRV2 sind in ihrer Aminosäurensequenz zu 86.3 % ident. Eine Folge davon ist die Bildung eines ternären Komplexes mit HRV1A 2Aprı/eIF4E/eIF4GII551-745, wie es auch für die HRV2 2Apro bestätigt wurde (Aumayr et al., 2015). eIF4E bildet einen binären Komplex mit der Proteinase, eIF4GII551-745 allerdings nicht. Die Ergebnisse stimmen mit jenen der HRV2 2Apro überein (Aumayr et al., 2015). Wir fanden mittels statischer Lichtstreuung heraus, dass HRV1A 2Apro aus zwei Monomeren besteht und 32 kDa wiegt. Die Dimerisierung der HRV2 2Apro wurde auch von Aumayr et al. publiziert. Der dreifache Komplex aus HRV1A 2Apro/eIF4E/eIF4GII551-745 ließ auf einen höheren oligomeren Zustand mit 133 kDa molekularer Masse schließen. Diese Masse Ließe sich durch einen doppelten ternären Komplex erklären. Wir haben die Thermodynamik der Wechselwirkung mit Isothermer Titrationskalorimetrie gemessen. Einerseits wurde eine Dissoziationskonstante von 1 µM für den ternären Komplex gemessen, andererseits fanden wir 7 µM für die HRV1A 2Apro/eIF4E Komplexe. Außerdem haben wir die Überexpression der rekombinanten HRV4 2Apro versucht. Dafür wurde eine Verlängerung am N-Terminus der HRV4 2Apro eingefügt, weil wir nicht genügenden Proteine vom Wildtyp erhalten konnten. Ein Hexahistidin-Tag gefolgt von acht Aminosäuren von VP1 am N-Terminus der Proteinase, verbesserte das Level der Expression. Die aktive HRV4 His6VP18 2Apro wurde zusammen mit Initiationsfaktoren auf enzymatische Aktivität getestet. Wir konnten zeigen, dass eIF4GII551-745 von der aktiven Proteinase innerhalb von zwei Stunden nicht prozessiert wird, auch wenn HRV4 His6VP18 2Apro zehnfach konzentrierte als HRV1A 2Apro war. Die Bindungsstudien zeigten auch, dass eIF4E und eIF4GII551-745 von der 2Apro der genetischen Gruppe B schlecht erkannt werden. Es wird kein ternären Komplex zwischen der inaktiven (C110S) HRV4 His6VP18 2Apro und den Initiationsfaktoren aufgebaut. Weder eIF4E, noch eIF4GII551-745 bilden Komplexe mit der Proteinase. Trotzdem haben wir eine mögliche Selbstprozessierungsreaktion bei der C110S Mutante von HRV4 His6VP18 2Apro an der VP1-2Apro-Region beobachtet. Die Substitution des aktiven Cysteins durch Serin konserviert vermutlich die schwache nucleophile Natur, die für die Selbstprozessierungsreaktion verantwortlich ist. SDS-PAGE Analysen zeigten eine möglicherweise selbstprozessierte zweite 2Apro-Bande mit Masse des Wildtyps. Ein wichtiges Ergebnis ist die monomere Natur der 2Apro von HRV4 His6VP18 im Unterschied zu den dimeren HRV1A 2Apro und HRV2 2Apro (Aumayr et al., 2015). Die nur 39 % der Aminosäurensequenz zwischen beiden 2Apro von HRV4 und HRV1A ident sind, erwarteten wir keine gleiche Struktur. Allerdings besteht die (CV) B4 2Apro des Coxsackie-Virus, welcher zu der Gattung Enteroviren gehört, aus einem Monomer (Baxter et al., 2006) und ist auch 39 % identisch zur 2Apro von HRV4 His6VP18. Dennoch kann die CVB4 2Apro einen ternären Komplex, allerdings keinen binären Komplex mit den Initiationsfaktoren bilden (Aumayr et al., 2015). Zusammenfassend gibt es bemerkenswerte strukturelle und Verhaltensunterschiede zwischen dem 2Apro aus der genetischen Gruppe A und B, die die Abschaltung der Host-Translation beeinträchtigen.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Deutsch)
HRV human Rhinoviren 2A Proteinase eIF4G eIF4E
Autor*innen
Öykü Üzülmez
Haupttitel (Englisch)
Investigating the mechanism of host translation shut off by human rhinovirus 2A proteinases
Paralleltitel (Deutsch)
Untersucht den Mechanismus der Abschaltung der Host-Translation, die durch humane Rhinovirus 2A-Proteinasen abgestellt wird
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
114 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Timothy Skern
Klassifikation
35 Chemie > 35.79 Biochemie: Sonstiges
AC Nummer
AC14494408
Utheses ID
40180
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |
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