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Characterisation of molecular causes for different ABCD2 gene expression in T-cells and monocytes

Johannes Binder

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Johannes Berger

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DOI

10.25365/thesis.45417

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-26748.22522.537159-1

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die X-chromosomale Adrenoleukodystrophie (X-ALD) ist eine erbliche Stoffwechselerkrankung, mit einer Häufigkeit von etwa 1 : 16800. Die Krankheit wird durch Mutationen im X-chromosomalen Gen ABCD1 verursacht, welches für einen peroxisomalen Transporter kodiert. In X-ALD ist mangels funktionalem ABCD1, der Transport von CoA-aktivierten überlangkettigen Fettsäuren (ÜLFS) in die Peroxisomen gestört. Aus diesem Grund akkumulieren ÜLFS im Gewebe und Plasma von Patienten. Dies führt zur Demyelinisierung von Nerven und im schlimmsten Fall zu Entzündungsreaktionen im Gehirn, Neurodegeneration und zum Tod. Das homologe Gen ABCD2 ist fähig den ÜLFS-Gehalt zu reduzieren, wenn es überexprimiert wird. Aus diesem Grund wurde die Induktion von ABCD2 als eine mögliche Behandlung für X-ALD vorgeschlagen. Leider ist die Regulation der ABCD2-Expression bisher noch unzureichend verstanden. Da ABCD2 in Immunzellen wie etwa T-Zellen, B-Zellen und Monozyten, in sehr unterschiedlicher Höhe exprimiert wird, kann ein Vergleich dieser Zellen regulatorische Mechanismen aufzeigen. Dazu wurden 3 verschiedene Methoden verwendet. Zuerst wurden phylogenetische Footprinting Daten verwendet um mögliche regulatorische Elemente zu finden die evolutionär konserviert sind. Durch den Vergleich der Sequenzidentität von 100 Wirbeltierarten ist es möglich funktionale von nicht-funktionalen Abschnitten zu unterscheiden. In Kombination mit vorhandenen ChIP-seq Daten können mögliche Bindepartner dieser konservierten Bereiche gefunden werden. Um die Funktion mutmaßlicher regulatorischer Elemente genauer zu bestimmen, wurden ChIP-seq Daten von Histon-Modifikationen untersucht. Posttranslationelle Modifikationen wie etwa Acetylierung oder Methylierung können die Genexpression beeinflussen, indem sie den Verpackungsgrad des Chromatins ändern oder regulatorische Faktoren rekrutieren. ChIP-seq Signale überspannen oft einen breiten Bereich, wodurch es schwierig ist genau zu sagen wo ein Protein gebunden war. Um ein genaueres Bild von den Bindestellen zu bekommen wurde ein in vivo Footprinting Verfahren mit CD3+ und CD14+ Zellen durchgeführt. Das in vivo Footprinting ermöglicht es sehr genau zu bestimmen, welche Bereiche der DNA in der lebenden Zelle von Proteinen gebunden waren. Mit dieser Methode sollen Zelltyp-spezifische Unterschiede gefunden werden, um die Regulation des ABCD2 Promoters besser zu verstehen. Unglücklicherweise hatten unsere in vivo Footprinting Daten zu starke Schwankungen, wodurch es nicht möglich war eine genaue Aussage über gebundene Stellen zu machen. Trotz mehrerer erfolgreicher Verbesserungen der Datenqualität konnten schlussendlich keine vertrauenswürdigen Ergebnisse erzielt werden. Die Analyse der phylogenetischen Footprinting Daten lieferte jedoch einige interessante Ergebnisse. Neben den bereits bekannten regulatorischen Elementen, enthält der Promoter von ABCD2 eine Reihe weiterer hoch konservierter Bereiche. Diese Bereiche spielen wahrscheinlich eine Rolle für die Regulation von ABCD2. Zusätzlich befinden sich zwei vermeintliche regulatorische Elemente weiter oberhalb des Promoters. Aufgrund von bestimmten Histon-Modifikationen und zugänglichem Chromatin ist es wahrscheinlich, dass diese beiden Elemente als Enhancer agieren. An beiden Stellen wurde der Myozyten Enhancer Faktor-2 (MEF2) gefunden. Durch Interaktionen mit dem Co-Aktivator p300 könnte MEF2 die Transkription stimulieren. Weitere mögliche Interaktionspartner und deren Effekt auf die Genexpression werden beschrieben, um die Ursachen für zelltypspezifische Unterschiede zu erläutern. Letztendlich soll dies dazu beitragen ABCD2 zu induzieren, als mögliche Behandlung für X-ALD.

Abstract

(Englisch)

X-linked Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inherited metabolic disease with a frequency of about 1 in 16800 new-borns. The disease is caused by mutations in the X-chromosomal gene ABCD1, which codes for a peroxisomal transporter. In X-ALD, due to ABCD1 deficiency the peroxisomal import of CoA-activated very long-chain fatty acids (VLCFAs) is impaired. Because of that, VLCFAs are no longer degraded by β-oxidation and accumulate in the plasma and tissues of patients. This causes demyelination of nerves and in the most severe form cerebral inflammation, neurodegeneration and death. The homologous gene ABCD2 is able to normalize VLCFA-levels upon overexpression, thus induction of ABCD2 has been suggested as a possible treatment for X-ALD. Unfortunately, the regulation of the ABCD2 gene expression is still not entirely understood. Because ABCD2 is expressed at very different levels in various immune cells like T cells, B cells and monocytes, a comparison between them can reveal regulatory mechanisms. To achieve this, three different approaches were combined. First, phylogenetic footprinting datasets were analysed to find potential regulatory regions that are evolutionary conserved. By comparing the degree of conservation between 100 vertebrate species, it is possible to distinguish between functional and non-functional areas of the promoter. Combined with information from available ChIP-seq datasets, factors that are bound to the promoter are identified. With this approach, it is possible to find candidate factors that are involved in the regulation of a gene. To further clarify the function of putative regulatory regions, ChIP-seq data for histone modifications was used. Posttranslational modifications like acetylations or methylations can affect gene expression by changing the accessibility of the chromatin or by recruiting regulatory factors. Knowledge of these epigenetic marks can help to understand cell type specific differences in the regulation of the ABCD2 promoter. Since ChIP-seq peaks often cover broad areas, it can be difficult to exactly pinpoint the corresponding binding site. To get a finer picture of utilized regulatory elements, an in vivo footprinting assay with CD3+ and CD14+ cells was done, from a region with a high density of conserved elements. In vivo footprinting helps to identify sites of the DNA that were bound by transcription factors in single base pair resolution. This data can then be used to find cell type specific differences. Unfortunately, the in vivo footprinting procedure did not work as expected. Our data had too high variations to make definite claims about bound regions. Numerous attempts to improve the data quality were successful, but despite these advances no reliable results could be generated. Nonetheless, the phylogenetic footprinting proved helpful for finding putative regulatory regions. Besides the already known elements that were described in the literature, the ABCD2 promoter contains two additional well-conserved regions. These regions are likely to play a role for the regulation of the ABCD2 gene. In addition, two putative regulatory elements were found further upstream of the promoter. Based on the presence of certain histone modifications and open chromatin it is likely for them to act as enhancers. At both putative enhancers the myocyte enhancer factor-2 (MEF2) is found. By interacting with the transcriptional co-activator p300, MEF2 bound enhancers could promote gene expression. In addition, also other potential interaction partners and their effect on gene expression are discussed to shed some light on the reasons for cell type specific gene expression. In the future, this might help to induce ABCD2, as a possible treatment for X-ALD.

Autor*innen

Johannes Binder

Haupttitel (Englisch)

Characterisation of molecular causes for different ABCD2 gene expression in T-cells and monocytes

Paralleltitel (Deutsch)

Charakterisierung der molekularen Ursachen für die unterschiedliche ABCD2 Genexpression in T-Zellen und Monozyten

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

67 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Johanner Berger

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.20 Genetik ,

44 Medizin > 44.77 Stoffwechselkrankheiten ,

44 Medizin > 44.90 Neurologie

AC Nummer

AC13473484

Utheses ID

40187

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter