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Generation of a virus library by simultaneous co-packaging of individual AAV-vectors
Christian Hüttmayr
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Simon Rumpel
DOI
10.25365/thesis.45601
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-20974.75757.921465-0
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Neurowissenschaft ist ein weites und interdisziplinäres Feld, welches das Nervensys-
tem in molekularen, zellulären, strukturellen, funktionellen, entwicklungsbiologischen,
evolutionären, medizinischen als auch mathematischen Aspekten zu beschreiben ver-
sucht, wobei große Bedeutung insbesondere der Vernetzung einzelner Neurone und de-
ren Interaktionen zukommt. Um kausale Zusammenhange zwischen der Struktur und
Funktion einzelner Neurone und höherer Gehirnfunktionen wie dem Verhalten herzustel-
len, ist die spezifische Manipulation definierter Elemente in eben diesen neuronalen Netz-
werken unvermeidlich.
In den vergangenen Jahren hat sich hierbei der Einsatz von viralen Vektoren als Standard-
werkzeug für die Transduktion von Neuronen in murinen Systemen etabliert und dabei
seine Fähigkeit unter Beweis gestellt, dies auch in einer räumlich und zeitlich definierba-
ren Art und Weise zu vermögen.
Einer der beliebtesten viralen Vectoren ist wegen seiner äußerst niedrigen Pathogenität
und seiner Fähigkeit auch nicht teilende Zellen zu infizieren, der rekombinante Adeno-
Assoziierten Virus (rAAV). Die Produktion solcher Vektoren ist jedoch immer noch sehr
Kost- und Zeitintensiv und viele Anwendungen benötigen die gleichzeitige Transduktion
einer Zelle mit mehreren Transgenen, besonders in Anbetracht AAVs stark limitierter Ver-
packungskapazität von nur rund 4.5 kbps.
In meiner These versuchte ich deshalb 10 unterschiedliche rAAV Vektoren parallel in ei-
nem Schritt zu verpacken und dessen Effizienz, sowie das Expressionslevel jedes einzelnen
Virus in vivo, mit Hilfe von Deep Sequencing und qPCR zu untersuchen. Im Zuge dessen
wollte ich zudem das Potential eines zeitgleichen Verpackens ganzer Gen-Bibliotheken
demonstrieren, indem ich versuchte mit Hilfe einer kleinen 10 Vektoren Bibliothek eine
Screening Methode für Signalsequenzen, die für den axonalen Tranport bestimmter
mRNAs verantwortlich sind, zu entwickeln. Hierzu verwendete ich 10 unterschiedliche Lokalisationssequenzen in der 3´UTR der letztlich exprimierten messenger RNAs, deren Fä-
higkeit zur Induktion eines axonal gezielten mRNA Transports entweder bereits in der Literatur bestätigt werden konnte oder deren transport-inerter Charakter als Negativkon-
trolle jeglichen axonalen Transport der mRNA verhindern sollte.
Ich fand heraus, dass die gleichzeitige Verpackung multipler rAAVs eine durchaus valide
Methode ist, die zu einer ausgewogenen Expression aller seiner Komponenten führt. Somit ist ein Multiplexverfahren in der Untersuchung unterschiedlicher Transgene oder
Transkriptions-Elemente möglich, welches wiederum zu einer Einsparung von Zeit- als
auch Manufakturkosten in den Experimenten führt und somit großes Potential für die Zu-
kunft zeigt. Ein mit Hilfe dessen verwirklichter Assay für die Suche nach mRNA Trans-
portsequenzen bedarf jedoch an Überarbeitung.
Abstract
(Englisch)
The Neurosciences are a broad and interdisciplinary field of study that try to characterize
the nervous system in molecular, cellular, structural, functional, developmental, evolu-
tionary, medical and mathematical terms; whereby particular importance is placed on the
interconnectivity of individual neurons and their specific interactions. In order to establish
a causal relationship between the structure and function of a neuron on one hand and
higher order brain functions such as behavior on the other, the specific targeting and ma-
nipulation of defined elements within those circuits is absolutely essential.
In recent years, the application of viruses has herein established itself as the customary
tool for the transduction of neurons in the rodent brain and proven successful to do so in
a spatially and temporally defined manner. Due to its very low immunogenicity and ability
to also infect quiescent cells the Adeno-Associated Virus (AAV) has especially proven use-
ful for the in-vivo application in neurons but the production of individual viruses is still
cost and time-intensive and many applications call for the simultaneous transduction with
various constructs, especially considering AAVs very limited packaging capacity of only
about 4.5 kbps.
In the course of my thesis I thereby tried to co-package 10 different rAAV vectors in par-
allel and characterize the efficiency of packaging as well as their individual expression
levels in vivo using both deep sequencing and qPCR. At the same time, I wanted to demon-
strate the potential of co-packaging whole libraries by using my small 10 vector library to
attempt and establish a novel screen for signaling sequences within mRNAs responsible
for axonal targeting. For this purpose, I used 10 distinct localization sequences within the
3’UTRs of certain messenger RNAs, whose ability to facilitate axonal targeted transport
has either already been shown in the literature or whose transport inert character would
prevent any axonal targeting as part of the negative control.
I found that the co-packaging of multiple rAAVs is a valid method that leads to an even
expression of all its components and thereby allows for the multiplexed characterization of different transgenes or transcription elements, leading to a reduction in time- as well
as manufacturing costs and shows great potential for future applications.
The screen for mRNA transport sequences based on these results although is in need of
revision and further experiments.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
AAV virus dna-library co-packaging transsynaptic
Schlagwörter
(Deutsch)
AAV Virus DNA-Bibliothek gleichzeitig verpacken transsynaptisch
Autor*innen
Christian Hüttmayr
Haupttitel (Englisch)
Generation of a virus library by simultaneous co-packaging of individual AAV-vectors
Paralleltitel (Deutsch)
Generierung einer Virus Bibliothek zur gleichzeitigen Verpackung individueller AAV-Vektoren
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
130 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Simon Rumpel
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC14519314
Utheses ID
40346
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |